《自然》子刊：癌癥患者血液中一半以上突變來自于白細胞

　　紀念斯隆·凱特琳癌癥中心（MSKCC）和GRAIL聯合研究團隊，今天帶來一項重要研究成果。

　　這項由MSKCC實驗病理學主任Jorge Reis-Filho和臨床醫學科學家Pedram Razavi共同領導的研究，對124例癌癥患者的cfDNA、腫瘤組織樣本和白細胞DNA，以及47名無癌志愿者的cfDNA和白細胞DNA，進行了超高深度測序（60000×）。

　　他們發現，腫瘤患者血液cfDNA中攜帶的大部分基因突變，可能不是來自于癌細胞，而是血液中白細胞。

　　具體說來，在癌癥患者的cfDNA中，克隆性造血帶來的變異可能占53.2%；而在健康的志愿者體cfDNA中，這一數字能達到81.6%。這意味著，克隆造血帶來的突變比科學家原來認為的要常見的多。

　　“看到這個結果，我們差點兒從椅子上掉下去。”Reis-Filho說[1]。

　　這也給液體活檢相關的研究提出了挑戰，在給患者開展液體活檢時，白細胞DNA應該是必檢項目，甚至需要開展超高深度的測序。

　　Pedram Razavi、David N. Brown和華人科學家Bob T. Li是共同第一作者。研究論文發表在頂級期刊《自然·醫學》上[2]。

從左到右：Pedram Razavi，Jorge Reis-Filho，Bob Li（圖源：MSKCC）

　　我們都知道，隨著人體各種細胞的死亡破裂，細胞的DNA會釋放到血液中，這些DNA就構成循環游離DNA（cfDNA）。同理，腫瘤細胞也會死亡，并往血液中釋放游離DNA，這就是我們所熟悉的循環腫瘤DNA（ctDNA）[3，4]。很顯然，ctDNA只是cfDNA中帶有基因變異的那一小部分[5-7]。

　　ctDNA的發現，讓科學家對癌癥的液體活檢技術寄予厚望。

　　雖然科學家想到了很多方法研究ctDNA[8-10]，但是仍難擺脫多種混雜因素的影響[11]。

　　其中影響比較大的一個是克隆性造血。

　　克隆性造血是那些有基因突變的造血干細胞，通過多系造血分化，形成攜帶同樣突變的終末分化成熟血細胞[12]。雖然其中一些突變會導致后代血細胞具備適應性優勢，出現不成比例的擴增[13]，但是這種克隆性擴增并不是惡性的。

　　克隆性造血會隨著年齡的增長而增加，之前有研究表明31%的老年人都會出現克隆性造血[14]。而且，導致克隆性造血的基因突變，也可以通過cfDNA檢測到[15]。

　　Reis-Filho等認為，克隆性造血肯定會影響腫瘤學家對cfDNA測序結果的解釋，尤其是很大一部分cfDNA片段源自造血細胞[16]。

　　盡管大量的研究表明，通過cfDNA檢測到的基因突變，與通過腫瘤組織檢測到的基因突變有很好的一致性[10]。不過，還是有科學家在cfDNA中發現了很多腫瘤組織中不存在的基因突變[6]。當然啦，這部分突變有可能是因為組織活檢取樣的不全面帶來的，也有可能是克隆性造血導致的。

　　關于這個問題，Reis-Filho等認為需要好好研究一番。

　　在2015年9月到2016年8月之間，研究人員一共招募了124名晚期未經治療或者進行性轉移的癌癥患者，其中乳腺癌（MBC）患者39名，非小細胞肺癌（NSCLC）患者41名，前列腺癌（CRPC）患者44名。另外還招募了50名沒有癌癥的志愿者，作為對照樣本，不過最終只有47名無癌志愿者的樣本有評估價值。

　　研究人員從癌癥患者身上獲取了腫瘤組織樣本、cfDNA和白細胞DNA，從無癌志愿者身上獲取了cfDNA和白細胞DNA樣本。

　　獲取樣本之后，他們基于已經獲得FDA批準的MSK-IMPACT平臺，給每個樣本獨立開展了深度高達60000×的測序（這個測序深度，成本該有多高……）。

實驗流程圖

　　從總體上看，基于腫瘤組織的活檢發現了740個突變，基于cfDNA的檢測包含其中的530（71.6%）。具體到各個癌種的話，比例也是類似的，乳腺癌72%，非小細胞肺癌和前列腺癌是71%。

　　而且，在cfDNA發現的基因突變中，有一些突變雖然在腫瘤組織檢測中出現，但是頻率極低，還有一些在腫瘤組織和白細胞中均沒有出現過（研究人員把它們叫做VUSOs）。

　　在確定了他們這個高深度測序方法的準確性和敏感性之后。研究人員推測，那些在腫瘤組織和白細胞中均沒有出現過突變，可能反應了腫瘤的進化和異質性。而攜帶這部分變異的腫瘤組織，可能沒有被活檢采集到。

　　通過以上數據，我們不難發現，cfDNA檢測和基于組織的活檢還是存在一定的差異的。

cfDNA檢測的主要基因突變分析

　　緊接著，研究人員又開展了一項探索性分析：是否可以通過cfDNA評估TMB、腫瘤突變特征和MSI。

　　分析發現，腫瘤組織活檢發現了6個高TMB的樣本，其中4例樣本也被cfDNA判定為有高TMB。不過，cfDNA還判定另外6個樣本為高TMB樣本，但是腫瘤組織檢測結果不支持cfDNA的結果。

　　在cfDNA確定的10個高TMB樣本中，有75%的突變是在腫瘤組織中出現頻率低，以及在腫瘤組織和白細胞中均沒有出現過的。據此，研究人員進一步推測，這可能確實是腫瘤的空間異質性導致的，它們只在一些部位出現超突變，而這個部位恰恰沒有被組織活檢取到樣。隨后的基因分析也從側面佐證了上述結果。

　　總結以上數據，研究人員認為，cfDNA測序可以準確檢測整個腫瘤基因組中很大一部分的突變，或許可以反映患者腫瘤的TMB、腫瘤突變特征和MSI。而且，cfDNA可以檢測到腫瘤組織活檢發現不了的亞克隆突變。

TMB分布圖

　　隨后，研究人員又分析了cfDNA檢測到的突變生物學來源。在無癌的志愿者樣本中，cfDNA檢測到的突變（364），有81.6%（297）出現在了白細胞DNA中；而在癌癥患者群體中，cfDNA檢測到的1727個突變，有53.2%（918）出現在了白細胞DNA中。

　　并且通過一系列的分析，研究人員認為，通過cfDNA進行超高深度測序發現的基因突變，不太可能是技術本身帶來的假陽性。而且，之前研究中開展的的白細胞DNA低深度測序[14，17-20]，可能大大低估了克隆性造血的普遍程度。

　　總之，在Reis-Filho團隊看來，他們提出的這種超高深度cfDNA測序分析，確定克隆性造血突變是cfDNA中非腫瘤突變的最可能來源。而且這個比例相當驚人，至少在這個研究中，93.6%的無癌志愿者的白細胞攜帶一個克隆性造血突變，而這一比例在癌癥患者群體中竟高達99.1%。

實驗設計過程圖

　　最后，論文作者在文章的討論部分指出了一個有趣的現象。他們認為，當前大多數臨床的cfDNA檢測，都沒有同時檢測白細胞的DNA。結合著這個研究成果來看，這種不同時檢測白細胞DNA的做法，肯定是不合適的。

　　不過，我今天特地了解了幾個國內頭部腫瘤測序公司的情況，基本都在檢測cfDNA的同時，檢測了白細胞的DNA，只是測序深度遠低于MSKCC這個研究。

　　無論如何，這個研究一方面證明了cfDNA檢測相較于組織活檢的優點，另一方面也警示相關研究人員，在檢測cfDNA的同時，一定要檢測白細胞的DNA，最好是超高深度測序。