一種簡單實用的提取植物DNA實驗

實驗方法原理 的提取是植物分子生物學和基因工程研究的一種基本的技術，至今已有了數種方法。此方法最大的特點是：將SDS同時用作細胞膜的去污劑和蛋白質的變性劑，變性的蛋白質通過離心而不是酚抽提除去，使得整個操作過程變得簡單快捷，比較溫和，1小時左右就可以獲得純化的植物DNA。用這種方法得到的DNA能直接被限制性內切酶酶解，純度較高，適用于分子生物學的研究。本實驗的目的是掌握DNA提取的原理和方法。

實驗步驟

一、材料與方法：

1、植物材料：螺旋藻（Spirulina platensis）、水稻（Oryza sativa）和煙草（Nicotianatabacum）.

2、試劑和溶液：

（1）20×SSC：3mol·L-1檸檬酸鈉，pH8.0：

（2）溶菌酶、10μg·μl-1Rnase、10%SDS（均為Sigma產品）；

（3）酚：氯仿：異戊醇=25：24：1

（4）TE：10mmol·L-1Tris-HCL、1mmol·L-1EDTA，pH7.6。

3、提取步驟：

收集對數生長期的螺旋藻細胞，懸浮于5倍體積（v/w）含2mg·mL-1溶菌酶的20×SSC中，室溫保持10分鐘，偶爾搖動混勻。水稻幼苗和煙草嫩葉在液氮中研磨成粉狀后，立即用5倍體積的20×SSC懸浮，并輕輕拌勻。上述懸浮液在冰上先放置3分鐘，然后加入10% SDS至終濃度為2%，混勻；繼續放置10分鐘后，在4℃用11000×g離心15分鐘。上清液轉移至新的離心管中，并用相同體積的TE稀釋，再加入RNase至終濃度為10μg·ml-1，室溫放置30分鐘。11000×g離心15分鐘，所得的DNA沉淀用70%的乙醇洗兩次后，真空中抽干或自然干燥，最后溶于適量的TE中。

二、結果與討論：

利用本方法，從煙草、水稻和螺旋藻中提取了DNA。因為整個過程的操作步驟較少，也較溫和，減少了DNA被弄斷的機會，所以所得的DNA分子量較大，大部分都比完整的λ噬菌體的DNA（48.5Kb）還大。另外，用此方法所提的DNA的OD260/OD280的比值1.8至1.9之間，并能被限制性內切酶酶切，顯示有較好的純度。

在使用本方法時，須注意下面的幾個問題。當20×SSC的懸浮液中加入SDS至2%后，溶液中會出現白色絮狀物質，表明蛋白質已經變性，這是本方法的主要特點之一。它通過變性后離心而不是常用的多次酚抽方法，將絕大部分的蛋白質除去。離心所得的上清液，需要用TE稀釋，這是因為溶液中的鹽濃度較高，如不稀釋，RNase就無法起作用；而且在沉淀DNA時，如用乙醇會將溶液中的鹽析出，如用異戊醇則形成兩相的界面，將溶液中鹽的濃度降低后，就解決了這些問題。但是，加大稀釋TE的體積，對于DNA的產量并無非常明顯的作用，用等體積的TE稀釋即可。DNA抽提液經RNase酶解后，再用酚：氯仿：異戊醇抽提一次，用以除去剩余的蛋白質和酶。本方法適用于大量和微量的DNA制備。大量制備時，RNase酶解和酚：氯仿：異戊醇的抽提步驟可以在DNA濃縮一些后再使用，這樣就較便于操作，并且節省RNase和酚。通常，用這種方法能從每克新鮮組織中提取到10至15μg的DNA。