親和層析法去除交叉反應性抗體實驗

緩沖液和溶液 細胞裂解緩沖液 NaOH Tris-緩沖鹽溶液 TBS Triton X-100 溶菌酶 胰 DNA 酶 I 制備用于文庫篩選的抗體 大腸桿菌培養液

離心和轉子 親和層析柱 溴化氫活化的 Sepharose 4B

材料

緩沖液和溶液

貯存液，緩沖液和試劑的組分請見附錄 12
將貯存液稀釋到適當的濃度。

細胞裂解緩沖液
0.1mol/L 醋酸鈉
1mol/L NaCl
用 0.45um 濾膜過濾細胞裂解緩沖液，室溫貯存。每 1L 培養細菌需要大約 100 ml 細胞裂解緩沖液。

NaOH(1mol/L)

Tris-緩沖鹽溶液（TBS) 和含 0.2%(m/V) 疊氮化鈉的 TBS

Triton X-100

酶和緩沖液

溶菌酶
使用分子生物學級的溶菌酶。加入固體洧菌酶以輔助裂解細菌。

胰 DNA 酶 I
在細胞裂解液中加入固體 DNA 酶 I 消化染色體 DNA。

抗體

制備用于文庫篩選的抗體
利用蛋白 A-Sepharose 親和層析制備的 IgG 片段，本方案可獲得最佳效果。用蛋白 Aipharoae 介質的親和層析法，請見 Harlow 和 Lane 法（1999)。

培養基

培養液
需要 1 升合適的大腸桿菌培養液。

離心和轉子

Sorval GSA 轉子或相當轉子
Sorval SS-34 轉子或相當轉子

專用設備

親和層析柱
5 ml 塞有玻璃棉的塑料注射器或 Bi-Rad Poly-Prep 柱子均適用。

溴化氫活化的 Sepharose 4B(Amersham Pharmacia Biotech) 或 Affi-GellO(Bia Rad)

載體和菌株
大腸桿菌作為制備表達文庫的宿主菌

方法

1. 將適當菌株（如 Y1090 hsdR、XLl-Blue 或 DH1) 的 1L 培養物培養至靜止期。

2. 用 Sorvall GSA 轉頭（5000r/min) 于 4°C 以 4000 g 離心 20 min 收獲菌體。

3. 棄去培養基，倒置離心管排出殘留培養液。

4. 將沉淀物重懸于 100 ml 的細胞裂解緩沖液中。

5. 加入 200 mg 溶菌酶，于室溫溫育菌液 20 min。

6. 加入 1 mg 胰 DNA 酶, 和 200ul Triton X-100。

7. 于 4°C 溫育菌液 1 h, 或溫育至上清由混濁變清亮且黏度降低。

8. 將細菌裂解液于 4°C 以 8000 g(8200r/min 用 SorvallSS-34 轉頭）離心 20 min, 小心將上清液倒入另一個燒杯內。

9. 用 1mol/LNaOH 將上清液 pH 調至 9.0。

10. 用 Lowry,Bradford 或其他方法檢測裂解液中蛋白的濃度。

11. 將提取液驟冷至 0°C, 并按操作說明將菌體蛋白質結合于溴化氫活化的Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10。

12. 使用前，用含 0.2%(m/V) 疊氮化鈉的 TBS 平衡與大腸桿菌提取物結合的 Sepharose 4B 或 Affi-Gel 10 樹脂。

13. 每通過親和層析純化 1 mgIgG, 需要 1 ml 固定體積的與大腸桿菌抗原相偶聯的樹脂。IgG 和偶聯的樹脂混勻后，在轉鼓中于室溫溫育 12~18 h。

14. 將勻漿液裝到親和層析柱上。用 TBS 洗脫抗體。收集洗脫液（每管 0.2 柱床體積）至OD280 降為 0。合并各管抗體，并將親和純化抗體貯存于-20°C, 以備免疫篩選時用。