213 DNA 修復能力比較 以3H2TdR 參入法測定非程序性DNA 合成(UDS) , 以表示DNA 總修復能力. 從F ig. 3 可見, 在紫外線照射后12 h 左右UDS達峰值. 衰老2BS 細胞的修復能力明顯低于年輕細胞(P < 0101).
214 斑點及Northern 印跡雜交結果分析 由斑點雜交結果可見, 紫外線照射6 h 后gadd 153 表達達峰值, 衰老細胞的gadd 153 可誘導性明顯低于年輕細胞, 結果見(Fig. 4). 根據斑點雜交結果選取紫外線照射后6 h 收集細胞, 進行Northern 雜交, 結果顯示(Fig. 5) , 紫外線照射后衰老細胞中gadd153、p 53、p 21 基因的可誘導性均明顯低于年輕細胞, 但其中p 53 誘導性改變最小. 另外, 這三種基因在紫外線損傷前的基本表達在衰老細胞及年輕細胞中也有所不同, 其中p 21 在衰老細胞中的基本表達明顯高于年輕細胞, gadd153 的表達在衰老細胞中似略高于年輕細胞, 而p53 的表達差異不顯著.
3 討論
細胞衰老是一個多因素、多途徑所致的復雜結果,DNA 損傷的積累及修復能力的下降可能是細胞衰老的重要原因之一[8] , 在DNA 受損后衰老細胞應答與年輕細胞有所不同. 衰老細胞的形態及增殖曲線的改變不明顯, 同時其恢復也緩慢. 流式細胞計檢測結果顯示, 衰老細胞G1 期阻滯率的增加幅度低于年輕細胞; 同時衰老細胞的DNA 修復能力顯著低于年輕細胞. 這些結果都說明衰老細胞對于DNA 損傷的應答能力明顯不如年輕細胞. 那么, 衰老細胞對DNA 損傷的應答能力下降的根本原因是什么呢? p53、p21 和gaddl53 等基因表達狀況在紫外線照射前后的變化可能為我們提供了一些有價值的線索.
DNA 損傷后, 會通過一定的信號傳導途徑引起細胞反應, 誘導眾多基因表達的激活或抑制,DNA 修復系統的激活則是細胞維持自身功能完整性和細胞生存的一個重要機制[ 9 ]. p 53 在DNA損傷監控中處于檢驗點控制的位置, 起著中樞作用,p21 及gadd153 均為其下游基因, 它們有著部分共同的途徑, 又可通過各自不同的途徑作用于細胞周期及修復系統, 在DNA 損傷修復基因調控網絡中既互相協同又相互影響, 發揮著各自不同的作用[9]. p21是周期蛋白激酶的抑制因子,作為p 53的下游基因, 在p 53與細胞周期調控之間起橋梁作用. p 21的高表達會導致細胞周期阻滯, 還會通過與PCNA (增殖細胞核抗原) 相作用影響DNA 的復制及其修復[3]. gadd153 在紫外線的誘導表達中也是依賴于p53的, 它作為p53 的下游基因,一方面對損傷后的細胞周期有一定影響, 另一方面可能與DNA 損傷修復偶聯. 有文獻報道, gadd153對轉錄因子C/EBP (CAAT增強子結合蛋白) 家族有負調控作用[10]. 實驗結果顯示, 經紫外線損傷后無論年輕及衰老細胞出現的G1 期的阻滯同時伴隨著gadd153、p 21、p 53 基因的高表達, 這說明這三種基因的可誘導與細胞周期阻滯有著直接的關系; 然而, 有趣的是衰老細胞在紫外線照射前即存在明顯的G1 期阻滯, 此時僅見p 21 的高表達, 這說明p 21對衰老細胞G1 期的阻滯可能起主要作用, 而p21的高表達是因為衰老細胞中存在的損傷累積不能被有效修復所致. 因為衰老細胞本身即存在明顯的G1期阻滯, 加之p 53、gadd153, 尤其是p 21 基因的誘導性下降, 可能是衰老細胞G1 期增幅低于年輕細胞的原因. 同時, 衰老細胞修復能力的下降也可能與gadd 基因(包括gadd153, gadd45 等)、p 21 及p 53 等基因的DNA 損傷后的可誘導性在衰老細胞中的下降有關. 實驗結果顯示, 衰老細胞中雖然p 21 這一細胞周期抑制因子的高表達導致了細胞的G1 期阻滯, 為修復損傷爭取了時間, 但其它與修復直接相關的基因卻不能有效地表達和發生作用. 實驗中還發現, p 53 表達變化并不十分顯著, 說明p 21 在衰老細胞中的高表達有可能通過非p 53 途徑調控[ 10 ]; 但另一方面這可能與p 53 作用通過磷酸化狀態的改變而實現有關[ 11 ] , 在損傷誘導后, p 53 蛋白與各種基因的結合活性可能通過其磷酸化狀態的改變而有所改變, 這同樣可能是衰老細胞中p 53 未見顯著高表達的原因之一. 然而, 這幾種基因在衰老細胞中的損傷可誘導性下降卻具有一致性, 這可能正是衰老細胞在DNA 損傷后細胞周期調控能力及修復能力下降的根本原因之一. 總之, 探討衰老細胞在DNA 損傷后細胞周期調控、DNA損傷修復以及DNA 損傷可誘導基因的表達改變, 有助于DNA 損傷修復基因調控網絡的闡明, 對于揭示DNA 損傷修復與細胞衰老的關系具有重要的理論意義.
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