使用合成核苷酸作探針實驗——在綠化四甲胺中（TMAC）雜交

寡核苷酸

LBSDSEDTATMAC

水浴鍋離心機培養箱尼龍膜

1.  按“在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交”介紹的方法處理已影印細菌菌落的濾膜。

2.  按下列方法制備帶擴增噬斑的濾膜

（1）從文庫中以漸減密度〔15 000~8 000噬斑 / 150 mm 平板）的方式將噬菌體鋪在瓊脂糖平板上。

（2）37 ℃培養至長出可見的噬斑。

（3）將噬斑影印到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜后，濾膜移至預熱的LB瓊脂糖平板上，37℃培 養5~12 h（轉印后冷室保存主平板）。

（4）將影印到膜上的噬菌體DNA變性并使之結合到濾膜上。

3.  轉印細菌菌落的濾膜按“在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交”的步驟1洗膜，然后將濾膜浸入50℃ 2×SSC / 0.5%SDS / 50 mmol/l EDTA，pH8.0溶液中洗滌，盡可能冼去濾膜上影印的細菌殘渣，然后用同洋的溶液再洗1遍。

4.  按每張濾膜5~10 ml 預溫的TMAC雜交液量，在15 cm 玻璃水晶盤中可移入多達30 張的濾膜，用塑料保鮮膜將玻璃盤封好。

5.  在雜交溫度下預雜交1 ~2 h。雜交溫度和洗膜溫度均應比解鏈溫度低5~10℃。

6.  預雜交后，將濾膜轉移到一個裝滿新鮮、預熱的TMAC雜交液的雜交容器中。

7.  并按毎毫升雜交液加入1×10⁶~2×10⁶ cpm³⁵P標記的寡核苷酸探針，于適當的溫度下溫育40~60 h。

8.  室溫下每張濾膜先用5~10 ml TMAC洗液洗滌，然后分別將濾膜轉移到200~ 250 ml 新鮮的TMAC洗液中，輕輕振蕩洗滌15 min。

9.  換上等體枳預熱的TMAC冼膜液，在適當的洗膜溫度下溫育1 h。

10.  再用等體積的2×SSC / 0.1%SDS洗膜液在室溫下洗膜，共3次，每次約10 min，以去除TMAC。

11.  最后按“在氯化鈉/檸檬酸鈉中雜交”進行放射自顯影。