免疫熒光組織化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，熒光素受激發光的照射，由低能態進入高能態，而高能態的電子是不穩定的，以輻射光量子的形式釋放能量后，再回到原來的低能態，這時發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術測定含量。
用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學分直接法、間接法和補體法。
1、直接法
（1） 檢查抗原方法
這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，制成特異性熒光抗體，直接用于細胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用于腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。
（2）檢查抗體方法
將抗原標記上熒光素，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體在原位檢測出來。
2、間接法
（1）檢查抗體（夾心法）方法
此法是先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。
（2）檢查抗體方法
用已知抗原細胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結合在抗原上的抗體反應，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。
（3）檢查抗原法
此法是直接法的重要改進，先用特異性抗體與細胞標本反應，隨后用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體與結合在抗原上的抗體結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用于同一種屬產生的多種第一抗體的標記顯示，這是現在最廣泛應用的技術。
3、補體法
（1）直接檢查組織內免疫復合物方法
用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原-抗體-補體—抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫復合物上補體存在處，此法常用于腎穿刺組織活檢診斷等。
（2）間接檢查組織內抗原方法
常將新鮮補體與第一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育后，如發生抗原抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原-抗體-補體—熒光抗體的復合物，此法優點是只需一種熒光抗體可適用于各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。
4、雙重免疫熒光組織化學標記方法
在同一組織標本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重熒光染色，一般均采用直接法，將兩種熒光抗體（如抗A和抗B）以適當比例混合，加在標本上孵育后，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發黃綠色熒光；抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。