免疫金標記檢測方法標準操作程序

【目的】
保證免疫金標技術檢驗準確性

【本SOP 適用范圍】
免疫金標技術

【該SOP 變動程序】
本標準操作程序的變動，可由任一使用本SOP 的工作人員提出，并報經下述人員批準簽字：專業主管、科主任。

【原理】
氯化金分子在還原劑作用下聚合形成金顆粒，顆粒與顆粒之間因靜電作用而相互排斥，使其保持一個比較穩定的膠體狀態，故稱作膠體金。利用膠體金顆粒的高電子密度及其表面能結合生物大分子(如抗體、SPA、植物血凝素和刀豆蛋白A 等)以 及具有一定顏色等特性，可用光鏡和電鏡對細胞內抗原進行定位、定性的研究。

【方法學分類】
1. 班點金免疫滲濾試驗 固相膜免疫測定中液體在微孔膜中穿過流出呈穿流形式，為斑點金免疫滲濾試驗(dot immunogold filtration assay，DIGFA)，亦有稱免疫金溶膠斑點法、滴金免疫測定法等。試驗單位為三層反應盒，第一層為過濾器(濾紙層)，第二層為反應膜(NC 膜或MC 膜)上點加有特異性抗原或抗體，第三層為吸水墊料，有稱此滲濾裝置為滴金反應板。
以雙抗體夾心法測dsDNA 為例：試驗中將標本加在反應盒上，血清(標本)透過過濾層進入反應層，反應層上點有“一”字形抗IgG(或某種人血清蛋白作為試驗陽性對照)及“．”形被測物相應抗體，血清中抗原與反應層中抗體結合，其余無關蛋白等濾出膜片，加入金標記抗體試劑，反應膜上“一”字形及“．”形均顯紅色為試驗陽性，僅“一”形顯紅色為試驗陰性(試劑盒狀態良好)，“一”不顯色提示試劑盒質量不合格，需另取反應盒重做試驗。試劑盒基本試劑成分有滴金反應板、金標記試劑及洗滌液。
2. 斑點金免疫層析試驗 固相膜免疫測定中液體通過毛細管作用在膜上向前移行呈橫流形式，為斑點金免疫層析試驗(dotimmunogoldchromatographyassay，DIGCA)。試驗單位為一濾膜條，自上而下分有多個層次。
如單克隆雙抗體法測HCG，濾膜條各區域分別為：吸水濾紙—固定有金標二抗的MC 膜—固定有抗β-HCG 抗體的MC 膜—金標記抗。α-HCG 玻璃纖維—吸尿玻璃纖維。試驗中將濾膜條浸入被測尿液或滴加尿液，尿液在毛細管作用下向試紙條上端緩緩移行，尿液將金標抗。α-HCG 溶解并帶動它向前移動，結合尿中HCG 至抗β-HCG 抗體處形成復合物，并在抗β-HCG 抗體固定處顯示膠體金特有紅色，提示試驗陽性。尿中無HCG時，溶解的抗α-HCG 至固定有金標二抗的MC膜處顯示膠體金特有紅色(質控線條)，提示試驗陰性。
試劑盒基本單位僅有一濾膜條，只有一步操作。
3. 膠體金顆粒的制備
在氯化金溶液中加入不同的還原劑，可制備出不同大小的金顆粒。常采用檸檬酸、抗壞血酸和白磷。用這三種還原劑可分別制備出大、中、小三種主要膠體金顆粒。目前，有更多的實驗室僅以檸檬酸為還原劑，在檸檬酸還原氯化金時，加入不同量的單寧酸即可獲得大小不同的金顆粒，所制備金顆粒的大小非常一致。
[1] 以抗壞血酸為還原劑制備10～15nm 直徑的膠體金(Au l5) 在一個洗凈烤干的250 ml 容量的三角燒瓶中，加入20ml 三蒸去離子水(3DW)、l ml 0.1 mol/L K2CO3和l ml％氯化金水溶液于冰浴中混勻，立即加入l ml 0.7％ 抗壞血酸，并充分搖動至溶液呈紫紅色，加3DW 至100ml，100℃水浴5min 后，溶液變成紅色，放室溫冷卻待用。
[2] 以檸檬酸為還原劑制備8～10 nm 直徑的膠體金(Au l0) 125 ml 3 DW 煮沸后加入1％ 檸檬酸7.5 ml，再煮沸5 min，迅速加入1.25 ml％氯化金溶液，100℃水浴15 min，溶液置室溫待用。
[3] 以檸檬酸為還原劑制備5—6 nm 直徑膠體金(Au 6) 將l ml 氯化金加入100ml 3DW 中煮沸，快速加進2．45ml 檸檬酸—單寧酸的混合液(2 ml 1％ 檸檬酸三鈉、0.45 ml 1％ 單寧酸)，繼續煮沸5 min，放室溫待用。
[4] 白磷為還原劑制備5 nm 直徑的膠體金(Au 5) 將120 ml 3DW、1.5 ml％氯化金和2.7 ml 1 mol/L K2CO3，混合，緩慢攪拌中快速加進l ml 白磷一乙醚溶液，室溫輕攪拌15 min，100℃水浴30 min 后放室溫待用。
膠體金制備一般需在中性pH(7.2 左右)條件下進行，也可在稍偏酸或稍偏堿的環境中進行。制備的膠體金其大小和形狀可在電鏡下觀察確定。一般膠體金溶液呈紅葡萄酒顏色，大顆粒膠體金是紫紅色。正常情況下，膠體金溶液應清澈而不含任何可見的沉淀或漂浮物，如溶液、試劑、瓶皿等不干凈。將造成如下結果：
第一不能獲得預期大小的膠體金顆粒，第二將影響到下一步生物大分子的吸附過程和包被后膠體金的穩定性。因此，為了獲得滿意的膠體金，應選擇最純凈的各有關試劑和液體。如有條件，所有試劑最好經過超過濾處理，以除去其中的分子聚合體和可能混入的雜質塊。制備過程中所用的水以三蒸去離子水最合適，各類
器皿均應嚴格清洗，盛膠體金的瓶皿先經過硅化則更為理想。膠體金顆粒在吸附生物大分子之前具有一定的穩定性，4℃可存放一周左右，如果經超過濾和透析處理后加0.002％ 疊氮鈉，能保存5 個月左右。