木 瓜 蛋 白 酶 水 解 IgG 成 Fab 片段摸索性試驗此 法 適 用 于 小 鼠（任何亞類）、大鼠、人 、山羊、綿羊、馬 、雞 、豚 鼠 和 牛 的 IgG水解。 材 料保存于 PBS (附錄 1 ) 中 的 2 mg/ml 純 化 的 IgG (單 元 1.5) 木 瓜 蛋 白 酶（2 X 結晶懸液； Sigma) 水解緩沖液：0.02mol/LEDTA (二 鈉 鹽 ）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鮮配制 ，冰上保存< l0h) 溶 于 PBS 的 0.3mol/L 碘 乙 酰 胺（從結晶體新鮮配制； Sigma) PBS 自制的微量透析槽或微量透析盒（如 Slide-A-Iyzer 透析盒； Pierce) 1.將 IOOud 2 mg/m l 純化的 IgG 加入標有 1?2 4 的 24 個微量離心管中。充分混勻木瓜蛋白酶懸液，不能振蕩。準備兩種濃度木瓜蛋白酶，溶 于 5m l 水解緩沖液中，濃度分別是 0.lmg/ml 和 0 .02 mg/ml。 2.將 100ul 0.1 mg/ml 木瓜蛋白酶液分別加入 8 個 IgG 離 心 管 中（酶/抗體比例為 1 : 2 0 ) ，將 IOOmI 0. 02 mg/ml 木瓜蛋白酶液分別加入第二組 8 個 IgG 離 心 管 中（酶/抗體比例為 1 : 1 0 0 ) ，最后，將 IOOmI 不含木瓜蛋白酶的水解緩沖液加入剩余的 8 個 IgG 離心管 中（對照組），所有離心管蓋上蓋子。 3.將所有離心管置于 37°C 水 浴 ，在不同時間取出一組離心管，制作水解時間曲線圖。一組離心管指一個 E/A 比為 1 : 2 0 的水解管，一 個 E/A 比 為 1:100 的水解管和一個對照水解管。水 浴 Ih 時取出第一組離心管，接著在第 2 h、 4 h、 6 h、 12 h、 18 h、 24 h 和48 h 分別取出第二至第八組離心管。取出一組離心管后每管加入 20M1 0. 3mol/L 碘乙酰胺中止水解。 4.用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒將水解混合物對 PBS 透析。 5.用 150 mmXl.5 mm 1 0 % 非還 原 SDS-聚丙烯酰胺 凝 膠 電 泳（單 元 12. 3 ) 分析水解產物 ，上 樣 量 為 80M 1。當 凝 膠 上 在 150kDa (表示未水解的抗體）和 120kDa (表示僅半胱氨酸起作用）處沒有顯示蛋白質條帶時，酶切反應完全。選 擇 水 解 IgG 獲取Fab 片段的最佳試驗條件，按基本方案 2 進行試驗。Fab 片段大小為 5 〇 kDa 左右， Fc 片段大小為 27kDa，在 24kDa 和 15kDa 處的細條帶是一些不重要的水解產物。 木瓜 蛋白 酶 水解 IgG 獲 取 Fab 片段的大量制備用摸索性試驗的方法確定獲取 Fab 片段的最佳試驗條件（見基本方案 1)。 材 料（帶 V 項 目 見 附 錄 1)木 瓜 蛋 白 酶（2 X 重結晶懸液； Sigma) 水解緩沖液：0.02mol/LEDTA (二鈉鹽）/0.02mol/L 半胱氨酸/PBS (新鮮配制，冰上保存< l0h) 溶 于 PBS (附錄1 ) 中濃度> lmg/m l的 IgG (總量> 5 mg，單 元 1. 5) 碘乙酰胺結晶 P B S ， p H 8. O 蛋 白 A 交聯瓊脂糖凝膠 CL-4B 聚丙婦酰胺葡聚糖 S-200 Superfine (Pharmacia Biotech) V 硼酸鹽緩沖液，可選 1 0 % (m/V) NaN3，可選 5 mmX IOOmm 層 析 柱（Bio-Rad) 26 mmX 900 mm 層 析 柱 (Pharmacia Biotech) 1.混勻木瓜蛋白酶懸液，避免振蕩。加入與待水解抗體相等體積的水解緩沖液溶解木瓜蛋白酶，選擇從摸索性試驗中已確定的最佳酶量、抗體濃度和孵育時間進行實驗。 2.將 木 瓜 蛋 白 酶 液 加 入 濃 度 為 溶 于 PBS 的 IgG 中，混 勻 ， 37°C 水浴至所需時 間（從基本方案 1 中確定）。加入結晶碘乙酰胺至終濃度0.03mol/L 中止水解反應 ，小心混勻，確保碘乙酰胺完全溶解。 3.將反應液轉至透析袋中（CPI 附 錄 3 H) ，在 4°C 下 對 2LPBSpH8.0 透 析 12?20 h。 4.準 備 5 mmX100 mm 蛋 白 A 交聯瓊脂糖凝膠 CL-4B 層 析 柱（單 元 1.5、 CPI 附 錄 31)，將透析液上樣。收集含有 Fab 片段和酶的未結合流穿液。如有需要，用 PBS 充分洗柱 ，收集所有 Fab 片段。 5.將 含 有 Fab 片段的流穿液濃縮至≤5 ml (CPI 附 錄 3 H)。 6.將濃縮液上樣至 26 mmX 900 mm聚丙烯酰胺葡聚糖 S-200 Superfine 層析柱，收集分子質量大小為50kDa 的組分，用 SDS-PAGE 法鑒定分子質量大小或使用預平衡的凝膠過濾層析柱。 7.將 1?80M 1終產物用1 0 % 非 還 原 SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳鑒定終產物的純度。通過測定A280值 ，確 定 Fab片 段 濃 度（表 1.5.1)。將 Fab片段保存在硼酸緩沖液中，于 4°C 保存；或者保存在含0? 02%NaN3 的 PBS 中，于一 70°C保存。 胃蛋白酶水解 IgG 成 F (ab’)2片段的摸索性試驗
胃蛋白酶水解IgG 獲 取 F (al/)2 片段的大量制備
備 選 方 案 用 預 先 活 化 的 木 瓜 蛋 白 酶 水 解IgG 制 備 F (ab)2
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