揭示生物學樣本和材料樣本原本無法觀察到的內部結構
冷凍斷裂是一種將冰凍樣本劈裂以露出其內部結構的技術。冷凍蝕刻是指讓樣本表面的冰在真空中升華，以便露出原本無法觀察到的斷裂面細節。金屬/碳復合鍍膜能夠實現樣本在SEM（塊面）或TEM（復型）中的成像，主要用于研究如細胞器、細胞膜，細胞層和乳膠。這項技術傳統上用于生物學應用，但現在逐漸在物理學和材料科學中展現出重要意義。近年來，研究人員通過冷凍斷裂電子顯微鏡，尤其是冷凍復型免疫標記（FRIL），對膜蛋白在動態細胞過程中所發揮的作用有了新的見解。
作者：Gisela H?flinger
圖1：麥葉上的蚜蟲
適合于電子顯微鏡的環境
電子顯微鏡的樣品室通過抽真空處理降至極低壓力。置于這種環境下的活細胞無法有效保全結構，因為細胞構成中的大部分水分會快速蒸發。
生物樣本的制備方法有很多種。樣品材料被（固定）保存，這樣后續脫水對原位結構的破壞最小，同時可以使用環境掃描電鏡（SEM）或者將水冷凍。高壓冷凍是觀察自然狀態下含水結構的唯一方法。高壓冷凍所形成的冰不是六邊形冰（從水變為六邊形冰時體積會增加）而是無定形冰，因此體積保持不變。所以，對滲透和溫度變化敏感的結構得以保留（見文章“高壓冷凍基礎介紹”）。
要觀察諸如細胞器、細胞膜、乳膠或液體的表面界面等結構，冷凍斷裂是唯一的方法。通過刀片（或類似物）或釋放彈簧負載的外力來破開冷凍樣本，并沿著最小阻力線斷裂樣本。
圖2：冷凍斷裂（來源：http://en.wikibooks.org/wiki/Structural_Biochemistry/Lipids/Membrane_Fluidity）
水的升華與凝結 – 冷凍蝕刻與污染
要暴露冷凍斷裂面，需要把冰去除。這就需要通過把斷裂面的冰升華去除以保存樣品的結構。升華的過程是冰不經過液態過程直接轉化為氣態。而液態過程會導致樣品體積和結構的破壞。
圖3：ES，細胞外表面；PF，細胞膜冷凍斷裂面；EF，細胞膜外層冷凍斷裂面；FS，細胞膜內表面；Cyt，細胞質
水的升華/冷凝過程取決于特定溫度下的飽和壓力，以及水或冰在室內的有效水分壓。
注意：良好的真空度會降低水分壓。
例如：溫度為-120℃的冰或冰凍樣本飽和壓力約為10-7
mbar。如果樣品室內達到這個壓力，則冷凝和蒸發處于平衡狀態。蒸發的分子數量等于冷凝的分子數量。在更高壓力下，冷凝速度要快于升華速度 –
因此冰晶會在樣本表面上生長。必須采取一切手段來避免這種情況。樣本上方一個較冷（比樣本更冷）的冷阱會降低局部壓力，從而起到了冷凝阱的作用。從樣本中帶出的水分子優先附著在較冷的表面上。在低于飽和壓力的壓力下，更多的分子升華而不是冷凝，同時會發生冷凍蝕刻。
執行冷凍蝕刻直到樣本完全無冰，這一過程稱為冷凍干燥。僅適用于合理時間內執行的小樣本。該過程分為幾個步驟，需要從大約-120℃加熱到-60℃，同時在每個步驟上使溫度保持一定時間。該過程需要幾天的時間來完成。
圖4：飽和蒸汽壓力（感謝Umrath 1982提供的圖片）
樣本溫度低于-120℃時，蝕刻速度非常慢，蝕刻持續時間會增加到不切實際的程度。如果真空室的壓力固定，則可以通過提高樣本溫度來提高蝕刻速度。對于生物樣本，要特別小心溫度高于-90℃。蝕刻速度會大幅提高。另外，要注意玻璃態冰中形成六邊形冰晶從而導致脫水偽像。
純水的理論升華速度會降低，因為：
樣本深處的水升華速度比表面的水更慢。
鹽和大分子溶劑會降低升華速度。
生物樣本中大量存在的結合水會降低升華速度。