凝膠純化實驗

蒸餾水 乙醇 甲酰胺 膠的緩沖液 亞甲基藍 十二烷基硫酸鈉儲存液 TAE 緩沖液 Tris 乙酸鹽 乙酸納 EDTA 藍色葡聚糖 TEN 緩沖液 40mer 聚丙烯酰胺膠

解剖刀 UV 燈 過濾 UV 的安全破璃

一、材料

1. 緩沖液、溶液和試劑

蒸餾水

乙醇，95%

甲酰胺 (使用安珀萊特單床離子交換樹脂 MB-1 除去離子，并儲存在暗中）

膠的緩沖液是標準的 TBE+6mol/L 尿素

亞甲基藍，100X，0.05%

十二烷基硫酸鈉儲存液，10%

TAE 緩沖液

40 mmol/LTris 乙酸鹽

20 mmol/L 乙酸納

0.2 mmol/LEDTA,pH8.3

藍色葡聚糖，1mg/ml

TEN 緩沖液

10 mmol/LTris-HCl,pH7.9

10mmol/LNaCl

0.1 mmol/LEDTA

2. 核酸和寡核苷酸

40mer(40bp 寡核苷酸）

3. 凝膠

聚丙烯酰胺膠，其中丙烯酰胺：雙丙烯酰胺的比值為 100:1(總共 12% 丙烯酰胺），膠的大小為 40 cmX20 cmX2 mm

4. 特殊設備

解剖刀

UV 燈 (UVGL-58,Ultraviolet 產品）

過濾 UV 的安全破璃

二、方法

1. 將每種 40mer 以1mmol/L 的終濃度懸浮在 TEN 緩沖液中，每個泳道（1cm 寬）僅上樣1000pmol(1ul+4ul 甲酰胺）。

2. 當 40mer 遷移了約 30~35 cm 時，將膠浸泡在蒸餾水中并更換兩次水，以除去尿素，然后用 0.0005% 的亞甲基藍染色過夜。可見的藍色條帶并非準確地同步遷移，這是由于序列效應的影響，盡管它們全都是 40bP 的寡核苷酸。另一種可以選擇代替染色的方法是用紫外投影的方法來檢測凝膠中的條帶，戴上護目鏡，用手持的 UV 光源從上方照射放于普通打印紙上的膠，肢中條帶的熒光要弱于周圍的熒光。

3. 用新解剖刀切下每一種的最主要的條帶，在 3 倍體積的 0.1% 的 SDS 和 TAE 中 37°C 浸泡 1 或 2 個晚上。回收上清液（避免膠的破碎），用 3 倍體積的乙醇沉淀。

4. 將經重新電泳、亞甲基藍染色后的 40mer 與一些加入的未經純化的 40mer 相比較，估計出 40mer 的產量，將其作為所有寡核苷酸的代表數據。在實驗中，整個的產率約為 30%, 這一數據被采用來針對所有的寡核苷酸。

5. 將寡核苷酸匯集，并將每一種的濃度在 TEN 緩沖液中調整到