幾種菌種的保存及復蘇方法

亦稱傳代培養保藏法，包括斜面培養、穿刺培養、液體培養等。是指將菌種接種于適宜的培養基中，最適條件下培養，待生長充分后，于4～6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養的菌種保藏方法。

操作步驟如下：
1.培養基制備

1.1器皿準備

培養基制備過程中所用的一些玻璃器皿，如，三角瓶、試管、培養皿、燒杯、吸管等，經洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

1.2溶解培養基配料

先在燒杯中放適量水，按培養基配方稱取各項材料，依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，攪拌均勻。

1.3調pH值

配料溶解后將培養基冷卻至室溫，根據要求加稀酸（0.1mol/L鹽酸）或稀堿(10%氫氧化鈉)調pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌，防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養成分被破壞。

1.4加凝固劑

配制固體培養基時需加凝固劑，如，瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補足所蒸發水分。

1.5過濾分裝

在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養基趁熱過濾并分裝。斜面培養基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。

1.6包扎標記

將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養基名稱及配制日期。

1.7滅菌

根據要求將培養基滅菌，通常蒸汽滅菌為121℃，15～20min。

1.8斜面擺放

滅菌后及時擺放斜面，斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。

1.9無菌檢查

將滅菌的培養基放入培養箱中作無菌檢驗，通常30℃培養1～3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。
2.接種

2.1斜面接種

2.1.1點接

把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌（如，毛霉、根霉等）。

2.1.2中央劃線

從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。

2.1.3稀波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌，也適用于部分真菌。

2.1.4密波狀蜿蜒劃線法

從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞，適用于細菌和酵母菌等。

2.1.5挖塊接種法

挖取菌絲體連同少量培養基，轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。

2.2穿刺接種

用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體，從柱狀培養基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。

2.3液體接種

挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養基中。
3.培養

將接種后的培養基放入培養箱中，在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30～37℃，真菌培養溫度一般為25～28℃。
4.保藏

培養好的菌種于4～6℃保存，根據要求每3～6個月移植一次。某些菌種，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，須1～3個月移植一次。

保藏濕度用相對濕度表示，通常為50%～70%。

斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照，防止因意外和污染造成損失。

亦稱礦物油保藏法,定期移植保藏法的輔助方法。是指將菌種接種在適宜的斜面培養基上，最適條件下培養至菌種長出健壯菌落后注入滅菌的液體石蠟，使其覆蓋整個斜面，再直立放置于低溫（4～6℃）干燥處進行保存的一種菌種保藏方法。

操作步驟如下：
1.液體石蠟的準備

選用優質化學純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，采用以下兩種方式進行滅菌：

121℃濕熱滅菌30min，置40℃恒溫箱中蒸發水分，經無菌檢查后備用。

160℃干熱滅菌2個小時，冷卻后，經無菌檢查后備用。
2.斜面培養物的制備

參照定期移植法。
3.灌注石蠟

將無菌的液體石蠟在無菌條件下注入培養好的新鮮斜面培養物上，液面高出斜面頂部1cm左右，使菌體與空氣隔絕。
4.保藏

4.1注入液體石蠟的菌種斜面以直立狀態置低溫（4～6℃）干燥處保藏，保藏時間2～10年。

4.2保藏期間應定期檢查，如，培養基露出液面，應及時補充無菌的液體石蠟。
5.恢復培養

恢復培養時，挑取少量菌體轉接在適宜的新鮮培養基上，生長繁殖后，再重新轉接一次。

是載體保藏法的一種。將培養好的微生物細胞或孢子用無菌水制成懸浮液,注入滅菌的沙土管中混合均勻，或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中，使微生物細胞或孢子吸附在沙土載體上，將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4～6℃或室溫進行保存的一種菌種保藏方法。

操作步驟如下：
1.沙土管制備

將河沙用60目過篩，棄去大顆粒及雜質，再用80目過篩，去掉細沙。用吸鐵石吸去鐵質，放入容器中用10%鹽酸浸泡，如河沙中有機物較多可用20%鹽酸浸泡。24小時后倒去鹽酸，用水洗泡數次至中性，將沙子烘干或曬干。

另取地面下40～60cm非耕作層貧瘠且粘性較小的土，研碎，100目過篩，水洗至中性，烘干。

將處理后的沙、土按質量比2∶1混合。混勻的沙土分裝入安瓿管或小試管中，高度為1cm左右，塞好棉塞，121℃濕熱滅菌30min。

隨機抽取滅菌后的砂土管若干支，無菌條件下取少許砂土至營養肉汁培養基中，30℃培養24小時，檢查無微生物生長后方可使用。
2.斜面培養物的制備

參照定期移植法。
3.制備菌懸液

向培養好的斜面培養物中注入3～5mL無菌水，洗下細胞或孢子制成菌懸液。用無菌吸管吸取菌懸液，均勻滴入沙土管中，每管0.2～0.5mL。放線菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。
4.干燥

真空抽去沙土管中水分。
5.保藏

將沙土管用火焰熔封后存放于低溫(4～6℃)干燥處保藏，每隔半年檢查一次菌種存活性及純度。或將沙土管直接用牛皮紙或塑料紙包好，置干燥器內保存，保藏時間2～10年。
6.恢復培養

無菌條件下打開沙土管，取部分沙土粒于適宜的斜面培養基上，長出菌落后再轉接一次。或取沙土粒于適宜的液體培養基中，增殖培養后再轉接斜面。

將微生物冷凍，在減壓下利用升華作用除去水分，使細胞的生理活動趨于停止，從而長期維持存活狀態。

【好氧菌冷凍干燥管的制備】

操作步驟如下：