凱氏定氮法測定食品中蛋白質含量的原理

原理：有機含氮化合物與濃硫酸共熱消化，氮轉化為氨，再與硫酸結合成硫酸銨。硫酸銨與強堿反應，放出氨。將氨蒸餾到過量的標準無機溶液中，再用標準堿溶液進行滴定。根據測得的氨量，計算樣品的總氮量。

、試劑與材料：

濃硫酸、硫酸鉀-硫酸銅粉末(稱取80g硫酸鉀和20g硫酸銅(五水)，0.3g二氧化硒研細混合)、30%氫氧化鈉溶液、2%硼酸溶液、0.01M標準鹽酸、混合指示劑(田氏指示劑)儲存液(取50ml0.1%甲烯藍乙醇溶液與200ml0.1%甲基紅溶液混合，儲存于棕色瓶中備用。此指示劑在PH5.2為紫色;PH為5.4為暗灰色或灰色;PH5.6為綠色;變色點為PH5.4)、硼酸-田氏指示劑混合液(100ml2%硼酸溶液，滴加約1ml田氏指示劑，搖勻后，溶液呈紫紅色)、蛋白質樣品、容量瓶、吸管、凱氏燒瓶、凱氏定氮蒸餾裝置、微量滴定管、電爐

三、操作方法

1、樣品處理：固體樣品，應在105℃干燥至恒重。液體樣品可直接吸取一定量，也可經適當稀釋后，吸取一定量進行測定，使每一樣品的含氮量在0.2-1.0mg范圍內。

2、消化：取一定量樣品，于50ml干燥的凱氏燒瓶內。加入300mg硫酸鉀-硫酸銅混合粉末，再加入3ml濃硫酸。用電爐加熱，在通風廚中消化，瓶口加一小漏斗。先以文火加熱，避免泡沫飛濺，不能讓泡沫上升到瓶頸，待泡沫停止發生后，加強火保持瓶內液體沸騰。時常轉動燒瓶使樣品全部消化完全，直至消化液清澈透明。

另取凱氏瓶一個，不加樣品，其它操作相同，作為空白試驗，用以測定試劑中可能含有的微量含氮物質，以對樣品進行校正。

3、蒸餾：將微量凱氏蒸餾裝置洗滌(先用水蒸氣洗滌)干凈。將凱氏燒瓶中的消化液冷卻后，全部轉入100ml的容量瓶，用蒸餾水定容至刻度。

吸取20ml稀釋消化液，置于蒸餾裝置的反應室中，加入10ml30%氫氧化鈉溶液，將玻璃塞塞緊，于漏斗中加一些蒸餾水，作為水封。

取一三角瓶，加入10ml硼酸-田氏指示劑混合液，置于冷凝管之下口，冷凝管口應浸沒在硼酸液面之下，以保證氨的吸收。

加熱水蒸汽發生器，沸騰后，夾緊夾子，凱氏蒸餾。三角瓶中的硼酸-指示劑混合液，吸收蒸餾出的氨，由紫紅色變為綠色。蒸餾15min，讓硼酸液面離開冷凝管口，再蒸1-2min以沖洗冷凝管口。空白試驗按同樣操作進行。

4、滴定：樣品和空白均蒸餾完畢后，用0.01M標準鹽酸滴定，至硼酸-指示劑混合液由綠色變回淡紫色，即為滴定終點。

四、計算 樣品總氮量(mg)=(A-B)×c×14×100/20

式中：A：樣品滴定時消耗的標準鹽酸體積 B：空白滴定時消耗的鹽酸體積 C：標準鹽酸的當量濃度 14：氮的相對分子量 20：用于蒸餾的稀釋消化液體積 100：稀釋消化液的體積

樣品中粗蛋白含量(mg)=樣品總氮量(mg)×6.25