結果
通過ChR2調控Vm
通過用FLIPR膜電位染料孵育ChR2轉染的HEK-293細胞，驗證了光激活ChR2對膜電位的調控。由FLIPRTETRA系統LED發出的藍光脈沖導致膜去極化，而FLIPR膜電位染料的信號增加了3倍(圖3a)。隨著時間的推移，膜電位信號的記錄顯示，當細胞膜重新極化時，從最初的藍光刺激到大約30分鐘后，熒光信號返回到背景水平。這一數據表明，當藍色光刺激ChR2打開時，Vm首先被去極化，隨著時間的推移，隨著ChR2通道關閉Vm重新極化(圖3b)，它的時間常數為6.9分鐘。
ChR2誘導的Cav1.3反應
轉染的HEK-293細胞與FLIPR鈣6染料孵育。隨著鈣離子進入細胞(圖4A)，藍色發光二極管發出的光脈沖觸發了熒光信號的增加。隨后的實驗(圖4B)中，使用雙脈沖檢測方案的細胞來識別Cav1.3通道從失活狀態恢復的時間依賴性。10分鐘間隔后，記錄到了原始鈣流一半的信號。45分鐘間隔后，幾乎100%的信號被記錄下來。數據顯示，在第一次光脈沖10分鐘后，一半的通道仍處于失活狀態，從而產生50%的最大鈣信號。
鉀離子的調控
用K+調控Cav1.3通道的狀態，轉染HEK-293細胞系中加載FLIPR鈣6染在37°C下孵育一小時，添加緩沖液增加鉀離子濃度從4mM到75mM以形成不同的膜電位(Vm)。然后在FLIPRTETRA系統中檢測鈣信號時添加75mM的高濃度K+。代表性的鈣信號響應如圖5A所示。K+依賴的失活曲線展示了與K+濃度對應的FLIPR鈣6染料信號，數據顯示誘發的50%最大Ca2+信號的鉀離子濃度是22mM(圖5B)，這表明在添加了此濃度的鉀離子條件下有一半的Cav1.3通道處于失活狀態。
藥理學
依拉地平是一種抗高血壓藥物，它也可能有助于減緩帕金森疾病癥狀的發展，因其對Cav1.3的狀態依賴性影響而被選為這項研究的對象。采用ChR2的光遺傳學檢測方案，表達了Cav1.3的HEK-293細胞在添加不同濃度依拉地平的情況下，用FLIPR鈣6染料在37°C下孵育一小時。在FLIPRTETRA系統上采用藍色光脈沖進行刺激，檢測到通道關閉狀態下鈣流熒光信號的強度的增加。10分鐘后，給予了第二次藍色光脈沖刺激，記錄到了通道失活狀態下鈣流熒光信號的變化。僅觀察到原始鈣流信號一半強度的熒光信號。在圖6A中，結果顯示為Cav1.3通道效應的%。高K+調控方案記錄的依拉地平的IC50曲線如圖6B所示。在較早的鉀離子調控實驗基礎上，將4mMK+或22mMK+添加到FLIPR鈣6染料的加載緩沖液中，分別誘導關閉和失活狀態。在FLIPRTETRA系統中檢測鈣信號時添加了75mMK+。膜片鉗方法下檢測的Cav1.3通道關閉和失活狀態下依拉地平的IC50曲線如圖6C所示。
總結
包括膜片鉗結果在內的所有Cav1.3通道關閉和失活狀態下依拉地平的IC50值得比較如表1所示。與關閉狀態下的值相比，所有檢測方法下得到的在失活狀態下的IC50值的左移大約為10倍。這很重要，因為對離子通道的復合效應在通道關閉和失活狀態下可能具有不同的臨床意義。通過光遺傳學檢測方案，IC50值更接近于以電生理方法獲得的IC50值。光遺傳學所獲得的“阻斷比例”值與電生理學方法所獲得的值高度相似，從而提示其高生物相關性。與電生理學不同的是，光遺傳學檢測中的細胞在實驗結束時完好無損。此外，光驅動的光遺傳檢測是可逆的，這是靈活的分析方法的一個非常理想的特性。
致謝
實驗工作和數據數據由意大利米蘭的AxxamS.p.A提供。
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