1. 準備貯存液和材料
0.1 mol/L K+ATP，pH 7.0
0.1 mol/L DTT（凍存在 -20℃，避免反復凍融）
0.1 mol/L CaCl2
0.1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0
肌動蛋白解聚緩沖液（慣稱冷緩沖液 A)：
2 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0
0.2 mmol/L ATP
0.5 mmol/L DTT
0.2 mmol/L CaCl2
該緩沖液可以配制成不含 CaCl2 的 50x 貯存液并凍存（-20℃ )。
2. 10 g 肌肉丙酮粉（用上文方法制備）和 200 ml 緩沖液 A 混合并在 0℃ 攪拌抽提 30 分鐘。
3. 不溶的碎片離心（SS-34 轉頭，16000 r/min，19950 g）10 分鐘。
4. 保留上清，0℃ 下在 20 ml 緩沖液 A 里重新抽提沉淀物 10 分鐘。
5. 再次離心（步驟 3 )；把兩次離心得到的上清混在一起并測量體積。
6. 邊在燒杯里攪拌，邊加適量體積的貯存溶液使抽提物中含 50 mmol/L KCI，2 mmol/L MgCl2 和 1 mmol/L ATP。
7. 在 4℃ 聚合 2 小時。
8. 在冰庫放 90 分鐘。
9. 邊攪拌邊使 KCl 濃度達到 0.6~0.8 mol/L 以去除原肌球蛋白。
10. 在冰庫里緩慢攪拌 30 分鐘。
純化肌動蛋白絲
11. 超速離心（50Ti 轉頭，35000 r/min，81000 g）3 小時以沉降絲狀的肌動蛋白。
12. 去掉上清并用含 0.6 mol/L KCl 的緩沖液 A 輕輕地洗沉淀的表面。為了去掉夾雜在肌動蛋白沉淀中的污染物，沉淀物在含 0.6 mol/L KCl 的緩沖液 A 中進行勻漿。超速離心（50 Ti 轉頭，35000 r/min，81000 g）3 小時以再次沉降肌動蛋白。
13. 超速離心管中挖出沉淀物并放到一個玻璃勻漿器中。最大限度地把絲狀肌動蛋白從管子轉移到勻漿器中，接著（例如在轉移了沉淀物后）在每個管子中加 1 ml 緩沖液 A 并孵育 1 小時。收集在緩沖液 A 中殘余的肌動蛋白，加到勻漿器中，另外再加緩沖液 A 使加入的緩沖液 A 總體積為 30 ml。用帶緊的研杵的 Dounce 牌勻漿器在緩沖液 A 中分散沉淀物，然后把勻漿物加到直徑 1 cm 的透析管中。
14. 透析 1.5 天，換 3 次緩沖液 A。在充分攪拌的溶液中，KCI 透析一半的時間大約是 5 分鐘，所以額外多換幾次液會有幫助。對肌動蛋白絲進行機械破壞也會加速肌動蛋白絲的解聚。
15. 超速離心（50Ti 轉頭，35000 r/min，81000 g）3 小時使 G-肌動蛋白溶液變清。
16. 測量肌動蛋白濃度。 展開 | 