動物來源產品中獸藥殘留的篩查

目的

為動物來源性產品中150多種獸藥殘留的篩查提供一種有效的解決方案。

前言

獸藥廣泛的應用于治療或預防動物疾病，但會帶來肉、魚、奶、蛋和蜂蜜等動物性產品中的痕量藥物殘留。由于對人體健康存在潛在的危害，食品鏈中藥物殘留的存在也引起了廣泛的關注。確實，污染的動物產品可能導致過敏反應或由于細菌抵抗的發展導致臨床治療上間接的問題。為了保護消費者的健康并確保動物性產品的質量，在世界范圍內設立了動物產品中藥物允許的最高含量，即最大殘留量（MRLs）1-3.

傳統上，生物材料中獸藥殘留由微生物和免疫組化技術進行分析4。而這些方法可以為特定類別的化合物提供一種快速經濟的篩查方法，每種測試盒一般僅對一種化合物有效，對模糊物質的鑒定缺乏選擇性，且結果僅近似定量。至于陽性結果，政府法規部門通常要求更加精確的色譜分析方法以確定抗生素的存在及含量。

由于MRLs相關法規變得更加嚴格，發展定量方法以及確認和鑒定技術以使假陽性結果最小化就更為重要。飛行時間質譜法（TOF MS）篩查具有一定的優勢，如歷史數據追蹤、簡化儀器方法設定和在增加化合物數量時方法的效果無需折衷，因而受到廣泛歡迎。然而，處理和檢查TOF篩查數據通常包含一個復雜的工作流程，當陽性峰首次確定后，隨后對消費者風險進行定量。定性向定量過程的轉化通常是手工完成的，它設置了一個明顯的數據檢查資源渠道及較高的誤差率。

該應用實例描述了Waters? 的ACQUITY UPLC?及四級桿飛行時間Xevo? QTof質譜用于超過150種獸藥殘留及代謝物，包括阿凡曼菌素、苯咪唑類、β-激動劑、β-內酰胺類、皮質類固醇、大環內酯類、硝基咪唑類、喹諾酮類、磺胺類、四環素類和其它獸藥產品的定點篩查。ACQUITY UPLC 分離分析速度較快，同時保持高效率和分離度。ACQUITY UPLC與Xevo QTof質譜相結合，以便保持高靈敏度的分離效率、檢測的選擇性和準確質量。數據采用POSI±IVE? 軟件處理，使得準確質量數據可在一個簡單通道中進行定性和定量，對陽性檢測物質則直接得出重要的定量結果。

實驗

樣品制備

此前曾有報道描述了牛奶的樣品準備方法4。對于肝臟、血、魚和肉樣品，采用5g樣品與20 mL乙腈和5 g 無水Na2SO4。離心后，在4ml上清液中加入0.4 mLDMSO。揮干乙腈，樣品加入0.8g水配成原來濃度，進樣前離心。附錄1列舉了篩查的獸藥殘留物質。

UPLC條件

LC 系統： ACQUITY UPLC
色譜柱： ACQUITY UPLC BEH C18
1.7 μm, 2.1 x 100 mm
柱溫： 40?C
流動相A： 0.1% 甲酸 （無水）
流動相B： 乙腈 + 0.1% 甲酸

梯度： 時間 (min) %A
            0.00 95
            0.25 95
            6.00 5
            7.00 5
            7.20 95
            9.00 95

流速： 0.40 mL/min
進樣量： 20 μL 滿定量環
MS條件
MS系統： XEVO QTof MS
采集模式： MSE
離子模式： ESI正
毛細管壓： 2.4 kV
錐孔電壓： 30 V
MS 碰撞能量： 6 V
MSE 碰撞能量范圍： 25 to 35 V
離子源溫度： 120 ℃
脫溶劑化溫度： 400 ℃
脫溶劑化氣體流速： 800 L/hr
錐孔氣流： 20 L/hr
采集范圍： m/z 50 to 1000 for 0.1 s

Xevo QTof質譜（采用甲酸鈉和鎖定質量檢測進行質量校準）采用IntelliStart? 軟件進行自動設置。


數據獲得及處理

數據采用Waters MassLynx? 4.1版本獲得，采用POSI±IVE 軟件處理。在MSE采集模式下，數據一直通過兩個通道進行收集：低碰撞能量（CE）用于分子離子信息；及高CE 用于子離子。圖1顯示了TOF篩選工作流。

圖 1. TOF篩查工作流程，自樣品準備至數據分析的理論步驟，包含確保該流程無縫運行所整合的儀器和軟件

結果和討論

對復雜材料的選擇性來源于ACQUITY UPLC的高色譜分離度和Xevo QTof質譜的高質譜分離率及其在較窄質量窗內重現質譜圖的能力。圖2顯示了牛肝臟提取物中達氟沙星的總離子流色譜圖（TIC）及其對應的精確質譜圖， 并以此為例。

圖2. 牛肝臟中達氟沙星的總離子流色譜圖（TIC）及其相應的質樸圖
高分離度對獲得結果的選擇性和提升可信性非常有幫助。然而，在一些情況下，額外的信息，如子離子，將可能對待檢的不確定化合物產生顯著的益處。圖3顯示了賽拉嗪和莫侖太爾監測結果中增加的可信性，兩種物質精確質量（m/z 221.1112）和元素組成（C12H16N2S）相同，保留時間相似（2.44和2.52 min）。賽拉嗪和莫侖太爾子離子相同（m/z 164.0536），但可由指定的唯一的子離子（m/z 90.0366和150.0381）進行鑒定。非常高的質譜分辨率將無法分離這些物質，因此結構信息對待檢殘留的模糊鑒定非常重要。

圖 3. 對相同精確質量相同的殘基進行清晰的鑒定, MSE下賽拉嗪（2.44 min）和莫侖太爾（2.52 min）

子離子信息可通過進行源內裂解，MS/MS或MSE獲得：

• 源內裂解是一種直接獲得產品離子的方式，但與MS模式相比靈敏度較低，且由于離子源條件隨著流動相和基質的改變難于控制。

•  MS/MS是一種基于數字的技術，它可以提供高質量的子離子譜，但工作周期較低，高豐度殘留時產生偏移，且必須在預先知道樣品的成分的情況下使用。

• MSE是一種ZL的基于數字的技術，可提供簡單、無偏移、平行的途徑，傳遞每個可檢測成分的準確質量分子（MS）及子離子（MSE）信息，無需多次進樣。

這些信息僅在子離子可于基質中相應水平被檢測到時有效。圖4顯示了牛血提取物中磺胺多辛在MSE模式下低碰撞能和高碰撞能質譜圖，證明了子離子可在基質中相應水平上被檢測。

圖4. 牛血中磺胺多辛在低CE 和高CE下的MSE模式質譜圖，顯示子離子可在基質中的相關水平上可檢測。

圖5 顯示了低CE和高CE在MSE模式下獲得的光譜的差異，低CE譜由分子離子主導，而高CE譜包含子離子，這增加了鑒定的可信性。
 

圖 5.牛血中磺胺多辛在低CE和高CE中MSE模式譜圖

分析樣品以便獲得9min的總循環時間（包括平衡時間）。這使得每天實際樣品處理量超過100種樣品。然而，這種樣品處理量以及每種樣品150種殘留物給數據處理和運算帶來了明顯的問題。

POSI±IVE軟件是專為降低檢查TOF質譜篩選數據的數據運算時間而研發的，確保僅有陽性（準確質量和保留時間在預定的偏差內）及暫時的（保留時間尚可，但標識為準確質量超限）檢測將自動定量。僅需要一張包含化合物名稱、結構式和保留時間的目標化合物列表A，而這一列表的長度不受限制。 

在自動運算過程中，POSI±IVE軟件執行定性搜索，采用質量準確度和保留時間決定化合物是否為陽性、暫時或未檢出，以生成目標列表中化合物存在/不存在的信息。所有陽性和暫時檢測隨后被自動定量，并采用TargetLynx 瀏覽器報告，含有同位素組成（iFit?）檢測的方式列出。圖6顯示了牛血提取物POSI±IVE Xevo QTof質譜篩查結果，超過150種獸藥中僅定性及定量檢測出3種：氫化可的松、磺胺多辛和甲氧芐啶。受試樣品中顯示出血樣中甲氧芐啶陽性鑒定和定量結果。 

由于其不包括在運算方法內，氫化可的松在原始定向分析中未有報告。POSI±IVE 半定向方式的優勢之一是殘留物列表的長度沒有限制，且無強制性校準標準。記錄的數據檔案將被新的信息重新運算，氫化可的松隨后即被檢測并在原始數據檔案中量化。

圖 7.牛血POSI±IVE Xevo QTof MS篩查報告表明存在3種殘留物

圖7牛血提取物生成報告中的一部分，其中150中殘留物范圍被縮小至3種經保留時間，精確分子量和iFIT鑒定為陽性。

結論

? 由于其對人體健康存在潛在危害，食品鏈中獸藥殘留的存在受到廣泛關注。

? ACQUITY UPLC和Xevo QTof 質譜方案簡化了動物源性產品中超過150種獸藥殘留物在適當的 MRLs下的篩查。

? 在對待檢殘留物指定鑒定時，MSE信息增加了額外的可信性，并克服了常規數據依賴性途徑的局限性。

? TOF MS數據信息豐富的特性增加了其對數據處理軟件的要求，因此降低手工處理并自動重復性任務對提高結果的質量和TOF MS的接受性非常必要。

? POSI±IVE通過確保僅有陽性和暫時的檢測可被自動定量，顯著降低檢查TOF質譜篩查數據處理的瓶頸。自動處理的性質通過在工作流程中除去了人工轉錄步驟，而降低了發生錯誤的可能性。
 

參考文獻

附錄1：