反義RNA的制備實驗

限制性內切核酸酶酶水解 模板 DNA 大腸桿菌 DNA 多聚酶 胰 DNaseⅠ

氯仿 苯酚 乙醇 DTTrNTP溶液 轉錄緩沖液 Tris-Cl 鹽酸亞精胺 NaCl 胎盤RNase抑制物 牛血清白蛋白 RNA聚合酶 DEPC

DNA合成儀 瓊脂糖凝膠電泳 微量離心管

一、化學合成的 RNA

RNA 也可以用來檢測目標基因的功能性結構域或用來調節基因表達。反義 RNA 與目標基因的特定結構域互補，能有效地形成穩定的 目標 RNA-反義 RNA 雜交體。

1. RNA 可用自動 DNA 合成儀合成，如 Applied Biosystem 的 DNA 合成儀。

2. 通常用 2'-OMe ( 甲氧基）RNA 和 2'-OMe 次黃嘌呤而不是用 2'-OMe 鳥嘌呤與胞嘧啶配對。

二、從載體/cDNA 克隆轉錄制備反義 RNA

RNA 也可以由線狀 DNA 為模板，通過 RNA 聚合酶（如 T3、T7 或 SP6 ) 在體外合成。

1. 將一段 DNA 序列插入載體的多克隆位點，這類載體在多克隆位點附近帶有噬菌體 RNA 聚合酶轉錄識別序列，即帶有 T3、T7 或 SP6 啟動子 ( 載體上克隆的 DNA 序列與目標基因相同，而其轉錄產物則是由載體上的啟動子從 3' 端開始轉錄產生的，因此轉錄產物 RNA 可與目標基因互補。

2. 用適當的限制性內切核酸酶酶水解，制備 2 pmol/L 的模板 DNA ( 1 pmol/L 3 kb 的質粒約為 2 μg )，并取一部分水解后的 DNA（約需 100 ng）進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

3. DNA 3' 末端的突出端可以用大腸桿菌 DNA 多聚酶的 Klenow 片段或噬菌體 T4 DNA 聚合酶在 4 種 dNTP 存在的條件下將其除去。

4. 用氯仿：苯酚純化模板 DNA，然后用乙醇沉淀。隨后把 DNA 溶于 TE ( pH 7.0 )，濃度約為 250~500 nmol/L。

5. 室溫下，在微量離心管中依次混合下列組分：DNA 模板 0.2 pmol，DTT (1 mol/L) 0.1 μl，rNTP 溶液（各 5 mmol/L） 1.0 μl， 10X 轉錄緩沖液 1.0 μl，400 mmol/L Tris-Cl（pH 7.5 37℃)，60 mmol/L MgCI₂，20 mmol/L 鹽酸亞精胺，50 mmol/L NaCl，胎盤 RNase 抑制物（10U ) 0.5 μl，牛血清白蛋白（2 mg/ml ) 0.5 μl，噬菌體 DNA 依賴的 RNA 聚合酶（10U ) 1.0 μl，用 DEPC 水補齊至 10 μl，以上緩沖液均應消毒并分管保存在 -20°C。

混勻各成分時要并避免氣泡產生。將反應液置于 37℃ 1~2 h ( T3 或 T7 RNA 聚合酶）或 40°C 1~2 h( SP6 RNA 多聚酶）。

6. 加入 1 μl 無 RNase 的胰 DNase Ⅰ(1 U/μl )，混勻，37℃ 反應 15 min。

7. 加入 100 μl 無 RNase 的水，用 1：1 的苯酚：氯仿純化RNA。

8. 將水相轉移至另一個離心管中，加入 20 μl 5 mol/L 的乙酸銨，混勻后再加入 250 μl 冰預冷的乙醇，-20℃ 靜置 60 min，12000 g 4°C 離心 20 min，收集 RNA。

9. 棄去乙醇，并使殘留的乙醇揮發干凈，將 RNA 沉淀溶于 100 μl 無 RNase 的水中。 加入 2 倍體積的冰預冷乙醇，混勻后分管 -70℃ 存放。在使用前，取出分裝管加入 0.1 體積的 5 mol/L 乙酸銨，混勻后置于 -20℃ 15 min 以上， 4°C 12000 g 離心沉淀，去凈乙醇，將 RNA 溶于適當體積的無 RNase 的相應緩沖液中。