在某些情況下，制備好的 λ 噬菌體 DNA 經限制酶的簡單消化即可用于克隆。但只有當所用載體能用遺傳學方法篩選含有外源 DNA 序列的重組噬菌體時（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），這種方案才是可行的。因為在這種情況下，不必采取步驟來減少非重組噬菌體的形成。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 在某些情況下，制備好的 λ 噬菌體 DNA 經限制酶的簡單消化即可用于克隆。但只有當所用載體能用遺傳學方法篩選含有外源 DNA 序列的重組噬菌體時（如 EMBL 系列、λ2001、λDASH、λZAP、λgt10），這種方案才是可行的。因為在這種情況下，不必采取步驟來減少非重組噬菌體的形成。 |
|---|
| 實驗材料 | 噬菌體 T4 DNA 連接酶帶有合適緩沖液的限制性內切核酸酶 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | ATP氯仿EDTA乙醇酚：氯仿乙酸鈉焦糖凝膠上樣緩沖液 |
|---|
| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
ATP ( 10 mmol/L )
氯仿
EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
乙醇
酚：氯仿（1:1，V/V)
乙酸鈉（3 mol/L，pH 7.0）（使用 pH 7.0 而不是常用的 pH 5.2 的乙酸鈉非常重要。因為對在消化后用來除去緩沖液中二價陽離子的 EDTA 來說，在 pH 5.2 且濃度超過 5~10 mmol/L 時，將從溶液中沉淀出來。）
焦糖凝膠上樣緩沖液（sucrose gel-loading buffer)
TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
噬菌體 T4 DNA 連接酶
帶有合適緩沖液的限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 核酸和寡核苷酸
λ 噬菌體 DNA
5. 專用設備
預置于 68℃ 的水浴
6. 載體和菌株
λ 噬菌體包裝混合物
二、方法
1. 將 25~50 μg λ 噬菌體 DNA 與 TE（pH 8.0）混合至終體積為 170 μl。
2. 加入 20 μl 10X 限制酶緩沖液。取兩份未消化的噬菌體 DNA，每份含 0.2 μg，置于冰浴保存。
3. 加入 3 倍過量（75~150 單位）的適宜限制酶，按廠家推薦的溫度消化 1 h。
4. 將反應于冰浴冷卻至 0℃。再取出一 0.2 μg 的組分，將其與另一份未經消化的 DNA ( 步驟 2) 于 68℃ 溫育 10 min，以打斷噬菌體 DNA 黏性末端。加小量（10 μl ) 蔗糖凝膠上樣緩沖液，立刻將樣品加入至 0.7% 的瓊脂糖凝膠中。
如果限制酶消化完全，則沒有 DNA 遷移至未消化的對照電泳帶處。相反，將會看到兩條或更多條（依賴于載體中切割位點的數目）較小 DNA 片段。仔細査看這些小片段的數量確證不存在部分酶切產物。
這一步并不像聽起來那么簡單。λ 噬菌體 DNA 的左、右臂帶有可互補的長為 12 堿基的末端，它們相互間可發生復性形成氫鍵，得到的 DNA 很容易與未切斷的噬菌體 DNA 相混肴。由于這個原因，當 DNA 樣品從 68℃ 水浴取出后應立即上樣和進行瓊脂糖電泳。
如果消化不完全，將反應加熱至適宜溫度，再加入限制酶（50~100 單位)，在廠家推薦的最佳溫度下繼續溫育。
5. 當消化完全后，加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0 ) 至終濃度為 5 mmol/L，用酚：氯仿和氯仿各抽提消化混合物一次。
6. 在 0.3 mol/L 乙酸鈉（pH 7.0 ) 存在下，用乙醇沉淀將 DNA 從親水相中回收回來。于 4℃ 在微量離心機中以最大轉速離心 2 min 收集沉淀，用 70% 乙醇洗滌后，將 DNA 重溶于 100 μl TE ( pH 7.6 ) 中，通過測定 260 nm 的吸光率確定其濃度。
7. 取一份 0.5 μg DNA，如下所述測試其連接能力：
(1) 用水將 DNA 溶液的體積調整至 17 μl。
(2) 加入 2 μl 10X 連接緩沖液，如果必要，再加入 1 μl 10 mmol/L ATP。
有些商品化連接緩沖液中含有 ATP。如果用這樣的緩沖液，就不再需要另加 ATP。
(3) 取 5 μl 步驟 (2) 中制成的混合物，冰浴保存。
(4) 在剩余的混合物（步驟(2) ) 中，加入 0.2~0.5 weiss 單位的 T4 DNA 連接酶，16℃ 溫育 2 h。
(5) 用一商品化的 λ 噬菌體包裝反應將 0.1 μg 的連接和未連接樣品以及 0.1 μg 的未消化載體 DNA 進行包裝。 |
|---|
