在此基礎上,實驗對海拉細胞中的高爾基體(mTFP1)和纖顫蛋白(EGFP)進行了在體成像,見圖3(j)-(n),青色為mTFP1,綠色為EGFP,實驗中兩種熒光蛋白同時成像,最終采用光譜分離法將不同蛋白的熒光信號分離出來。
圖4 海拉細胞在體延時三維觀察高爾基體的成像結果
后續還進行了海拉細胞的活體高爾基體的三維時間分辨成像,實驗使用60×/NA 1．3的硅油浸物鏡及直徑為1．0AU的小孔。二維圖像采集的幀速率為20fps,利用樣品中40個不同層的熒光圖像形成3D熒光體成像,1次體成像需要2 s采集,然后重復采集18次,成像體積大小20×20×2μm(xyz)。激發波長為530 nm,激發強度為1．25×105 W/cm2,成像結果見圖4。
圖5 PI處理后的海拉細胞熒光圖像
后續實驗使用碘化丙啶(PI)來指示細胞在7、8、9和10分鐘的延時觀察后的損傷情況,來驗證該光學系統對活細胞長期觀察的適用性。在觀察期間,88個焦點以100毫秒的曝光時間,曝光間隔1s照射樣品,激發強度為3．21×104W/cm2,激發波長為525nm,使用前文提到的60×物鏡及1．0AU孔徑,圖5(a)-(d)為引入PI的成像圖,(e)-(h)為相應的相應襯度圖。改變激發條件為每照射500ms間隔5s,得到相應的(i)-(p)。由圖像可知,延時觀察小于8分鐘的情況下不造成可見細胞損傷,對于實際3D延時成像,由于焦平面是移動的,所以預期細胞存活時間會更長,可見這是一種在3D在體延時成像中具有很大優勢的成像方案。
由于具有較高輸出功率的光源可以提高成像速度,在我們的實驗中,時間分辨率主要是受OPO輸出可見光激光功率的限制。盡管在單點掃描系統中,v2PE激發會使得空間分辨率提高,但多聚焦v2PE顯微鏡具有與1PE多聚焦顯微鏡近乎相同的橫向分辨率,這主要是多聚焦成像和單點掃描技術之間的差異造成的。由于v2PE的激發體積小于1PE,引入圖像掃描技術可以進一步提高空間分辨率,這種技術需要通過在針孔陣列前引入額外的微透鏡陣列來實現。除此之外,由于可見光區域的共振效應,可能會產生光漂白,因而為了延長觀察時間,系統還需要對激發強度和曝光時間做進一步優化。
參考文獻:
[1] Ryosuke Oketani, Haruka Suda, Kumiko Uegaki, Toshiki Kubo, Tomoki Matsuda, Masahito Yamanaka,Yoshiyuki Arai, Nicholas I． Smith, Takeharu Nagai, Katsumasa Fujita, “Visible-wavelength two-photon excitation microscopy with multifocus scanning for volumetric live-cell imaging,” J． Biomed． Opt． 25(1), 014502 (2019)