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    發布時間:2021-03-01 16:15 原文鏈接: 臺盼藍(TrypanBlue)染色法技術要點(二)

    在下面的小視頻中,臺盼藍染料被緩緩加入在室溫培養了168小時的Jurkat細胞。大家可以清楚地看到部分細胞被染成藍色后迅速膨脹和破裂,染色隨即變淺,細胞失去形態變成“氣球“。整個過程僅幾秒鐘。
     


    有視頻為證,這些“氣球“狀物體就是死細胞的殘骸。但當我們在顯微鏡下計數時,這些“氣球”由于顏色太淺通常不會被計在內,因而導致死細胞的漏數和存活率的高估。研究者們將同樣的樣本用熒光核酸染料AO/PI或PI染色,并用Cellometer 細胞計數儀檢測了所有樣本的存活率。
     


    從曲線圖中可以看出,臺盼藍染色測得的細胞存活率(藍色和紅色曲線)總是高于熒光染料AO/PI和PI測得的存活率(綠色和紫色曲線)。當存活率高于80%時,臺盼藍和熒光染料測得結果間的差距較小;而當存活率低于80%時,兩種方法測的結果間的差距會有顯著差距,最高可達30%!因此我們強烈建議對于存活率低于80%的細胞樣本應該用熒光染核法(比如AO/PI)檢測細胞濃度和存活率[1]。

    誘導的瞬間死亡


    研究者們將Jurkat細胞分為兩份,一份用沸水浴處理15分鐘,一份不處理。處理過的細胞被認為0%存活,不處理的細胞被認為100%存活。將這兩份細胞按比例混合得到存活率為0,25,50,75和100%的細胞樣本。用0.4%臺盼藍或PI(碘化丙啶)熒光染料分別給樣本染色并用Cellometer 細胞計數儀計數。
     


    上圖是預期存活率為100,50和0%的樣本的染色效果。不同于自然死亡的細胞,熱水浴誘導的死細胞臺盼藍染色后都變成了深藍色,形態完整,沒有出現“氣球“狀細胞。
     

     

    此外,臺盼藍和PI染色測得的細胞存活率高度一致,也和預期存活率相當接近。為什么沸水浴處理的細胞和自然死亡的細胞在臺盼藍染色上會有這么大的區別呢?一個可能的原因是沸水浴增加了細胞膜的通透性但膜依然保持完整,使得臺盼藍可以滲入到死細胞中卻不會向外擴散。

    根據這些圖片、視頻和數據,研究者們提出了一個假設:細胞膜通透性增加而依然完整時,臺盼藍可以滲入并留在細胞內,細胞呈深藍色并具有細胞形態;當細胞膜進一步破損時,滲入的臺盼藍會撐開細胞膜并擴散到周圍,形成“氣球”狀物體,細胞形態隨之消失[1]簡言之,此時的死細胞已經”Hold”不住臺盼藍了。


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