哈佛大學實驗室發現CRISPR／Cas9存在嚴重脫靶效應

　　哈佛大學David R Liu實驗室利用體外篩選和高通量測序檢測CRISPR/Cas9的脫靶，針對CLTA基因的四個不同靶位點共設計了八條不同序列的gRNA，即每個靶位點有兩條gRNA，結果發現，四個靶位點均存在脫靶現象，脫靶效率最高可達 84%，同時CRISPR/Cas9的特異性僅與gRNA配對的靠近PAM處7-12bp堿基相關，CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶效應。該研究成果發表在《Nature Biotechnology》雜志上。

　　CRISPR/Cas9是一種來源于細菌獲得性免疫的由RNA指導Cas9蛋白對靶向基因進行修飾的技術。有文獻報道，CRISPR/Cas9的切割是通過向導RNA(gRNA)與基因組位置之間20bp堿基的配對，且配對堿基的5′端需要有PAM結構(NGG)，再引導Cas9作用實現的，但是CRISPR/Cas9與靶位點識別的特異性主要依賴于gRNA與靠近PAM處10-12bp堿基的配對，而其余遠離PAM處8-10bp堿基的錯配對靶位點的識別影響不明顯，這項研究直接說明了CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶性，即該技術可以發生非特異性切割，引起基因組非靶向位點的突變，這樣會造成研究結果的不確定性以及研究工作的大量增加，這一問題嚴重地限制了Cas9的應用。

　　哈佛大學David R Liu實驗室為了研究CRISPR/Cas9技術的脫靶效應的程度，針對人CLTA基因的四個不同靶位點共設計了八條不同序列的gRNA，即每個靶位點有兩條gRNA，并通過體外篩選和高通量測序檢測脫靶效應發現，四個靶位點均存在脫靶現象，脫靶效率最高可達84%。同時與以前的研究結果對比，本研究得出 CRISPR/Cas9的特異性僅與gRNA配對的靠近PAM處7-12bp堿基相關。因此，特異性非常低。實驗結果還表明，在體外和細胞中gRNA的活性和特異性是需要權衡的，長度短的gRNA比長度長的gRNA特異性更高，而活性卻是相反的。研究人員還發現，gRNA:Cas9混合物濃度的提高會提高 Cas9的切割活性，但是進一步降低了gRNA:Cas9混合物打靶的準確性，包括會在PAM附近引起突變，從而增強脫靶效應。

　　背景介紹：

　　目前最常用的基因修飾技術有ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9。ZFN由一系列鋅指蛋白和Fok I非特異性核酸內切酶構成，兩個ZFN分別結合到靶序列后，激活Fok I使DNA特定位點產生雙鏈斷裂，但是ZFN技術存在不能識別任意目標基因序列、識別序列經常受上下游序列影響以及費用昂貴等問題。TALEN由TALE 蛋白和FokI 核酸內切酶組成，利用TALE的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化組合蛋白，從而達到識別內源性基因的目的。

　　FastTALE技術的出現使得TALEN質粒的構建可以很容易地在1天內完成，從而進一步推動了TALEN技術的應用。CRISPR/Cas9是由CRISPR相關基因和Cas9 基因組成，Cas9會在gRNA的指引下，在完整基因組上的特定位點完成切割反應，同時CRISPR/Cas9的切割也依賴于gRNA和基因組特定位點配對區5′端的PAM結構，這也進一步限制了gRNA的設計。

　　更為重要的是，文獻中報道CRISPR/Cas9存在嚴重的脫靶效應，此特性的存在一方面對細胞水平的打靶在基因功能的研究會造成混亂的局面，很難分析某功能的缺失是由哪個基因的敲除引起的，另一方面在動物模型應用中，CRISPR/Cas9的脫靶性盡管可以通過多代交配的方式稀釋脫靶，但是這個過程會增加工作量和科研經費的開支，因此限制了CRISPR/Cas9的應用。