實驗方法原理
流程圖
實驗材料 溶液和緩沖液原位雜交
試劑、試劑盒 RNA 聚合酶地高辛-UTP 標記混合物
實驗步驟
一、制備地高辛標記的探針
將 cDNAs 克隆入 pBluescript 載體中。為了能在體外轉錄，質粒需經線性化或 PCR 然后根據插入 cDNA 的方向應用 T3 或 T7RNA 聚合酶合成反義 RNA 探針。體外轉錄之后，DNA 模板用 DNA 酶 I(無 RNA 酶）降解，cDNA 水解成大約 200 個核苷酸的片段。
質粒的線性化：用合適的限制性內切酶在緊鄰插入序列終止密碼子的下游位點切開質粒。然后通過苯酚抽提，乙醇沉淀的方法純化 DNA。
PCR 擴增插入序列：根據 pBluescript 中 T3 和 T7RNA 聚合酶啟動子的側翼序列設計引物，經 PCR 擴增 cDNA，然后經凝膠電泳提純 DNA。
(這些技術的詳細介紹可參見 Maniatisetal.1982)
探針制備
1.下列物質加入滅菌微量離心管：
2.短暫離心后 37℃ 溫育 2 h。
3.加入 1ulDNA 酶 I(無 RNA 酶)，37℃ 溫育 10 min。
4.探針水解：管中加入以下物質：
5.混勻后冰浴，小于 Ikb 的探針冰浴 30 min, 大于 Ikb 的探針冰浴 60 min。
6.溫至室溫（室溫為 25℃), 加 20 mllmol/L MES。
7.加入 28 ml7.5mol/L 乙酸銨和 412ul 冰預冷乙醇來沉淀探針（如在-70℃ 則至少沉淀 30 min, 如在-20℃ 則至少沉淀 2 h)。
8.臺式離心機 12OOOr/min, 離心 10 min。
9.棄去上層清液（操作時小心勿將沉淀物倒掉)，然后用 70% 的冰預冷乙醇洗滌沉淀。
10.12000r/min，離心 lOmin，盡可能將乙醇倒盡，扣干沉淀。
11.最終產物為 2~4RNA，溶于 25ul 經 DEPC 處理過水中。產物的質量濃度為 80~160ng/ul。
探針的質量控制參見第二章。
雜交緩沖液
DNA 在 90~100℃ 的 0.1~0.2md/LNa+溶液中發生變性，在低于解鏈溫度 (Tm)25℃ 時，其復性率最高。對于原位雜交（ISH)，這就意味著必須延長微量樣品在 65~75℃ 中的雜交時間，然而這樣的高溫會嚴重影響細胞的形態結構。目前解決這一問題的方法主要是應用可以降低核酸雙鏈熱穩定性的有機溶劑，這樣原位雜交就可以在較低的溫度下進行。甲酰胺已被廣泛地應用，因為在一定濃度它可以呈線性地降低 DNA 雙鏈 Tm, 即甲酰胺的濃度每增加一個百分點，Tm 將降低 0.72℃。可以通過下面的公式計算甲酰胺對 Tm 的作用。
RNA 與 RNA 之間可以形成穩定的雙鏈，因此，當我們利用 RNA 探針進行原位雜交時，需要嚴格的雜交條件。以我們的經驗來看，含有 60% 甲酰胺的雜交混合物在 50℃ 雜交時，將得到很好的效果。
制備含 60% 甲酰胺的雜交混合物
在 50 ml 滅菌聚丙烯管中加入：
雜交緩沖液應避光，并在冰箱中保存。
經酸堿裂解的鮭魚精 DNA 按下列步驟制備：
1.在 50 ml 滅菌管中加入 Ig 鮭魚精 DNA, 加入 15 ml 經 DEPC 處理水，浸泡 15 min 到 2 h。
2.加入 2.5 ml2mol/L 鹽酸，室溫放置。DNA 逐漸形成白色沉淀，充分振蕩直至沉淀物黏聚在一起』然后用巴士德管管尖吹打 2~3 min, 使沉淀物成球狀。
3.加入 5.0 ml2.0mol/LNaOH，振蕩 DNA 使之重溶，于 50℃ 溫育 15 min, 以加快 DNA 溶解。
4.DEPC 處理水將混合液稀釋至 175 ml, 確保無顆粒存在。
5.入 20 mlImol/LTrisHCl(pH7.4)。
6.用 2mol/L 鹽酸將 DNA 溶液的 pH 調至 7.0~7.5。
用滅菌微孔濾器過濾溶液，除去所有結塊沉淀：測定溶液 260nm 的吸光度。吸取 20ulDNA 溶液加入到 980ul 水中。吸光度的 40 倍即為 DNA 的質量濃度，單位為 1ug/ug。將其分裝為質量濃度 4 mg/ml 的溶液，-20℃ 下保存。
培養神經元的原位雜交
神經元的分離和培養參見第十章所提供的方法。
由于我們選用 RNA 探針進行原位雜交，就必須采取措施防止 RNA 的降解。因此, 實驗操作必須戴手套，使用無菌的移液器槍頭、微量離心管以及不含 RNA 酶的緩沖液 [用 0.25%DEPC 處理重蒸（餾）水，37℃ 溫育過夜，然后高壓滅菌]。
所有的溶液都應該用孔徑 0.22um 的濾器過濾，因為培養皿中的任何小顆粒都能破壞神經元。
1.細胞固定至少 2 h。應緩緩地將固定劑加入培養皿中，避免換培養液時剝離神經元細胞。固定無脊椎動物（如軟體動物）神經元時，采用 1% 多聚甲醛和 1% 乙酸組成的混合液。而對于脊椎動物神經元，推薦使用 4% 多聚甲醛，乙酸的濃度可以增至 5%(Dirks1996)。乙酸是很好的核酸固定劑。
2.固定液中加入終濃度為 0.5% 的 NonadetNP40，然后溫育 30 min。
3.緩沖液 1 洗滌 2 次，每次 10 min。
4.(可選用）在 37℃ 下用 0.1%~0.005% 胃蛋白酶液（溶于 0.2mol/L 鹽酸中）處理細胞 10 min。此步驟可以使探針易于接近細胞中的靶 mRNA。在我們的實驗中，完全省略了蛋白水解酶處理這一步，也沒有發現顯著的信號丟失。這樣，我們省略了士驟 5~8。.
5.2% 多聚甲酵固定 4min。
6.1% 羥基氯化銨（溶于緩沖液 1 中）處理 15 min。
7.緩沖液 1 洗漆，5 min。
8.用無探針的雜交緩沖液中做預雜交，50℃ 溫育 lh。此步驟不一定是必需的，但每次都應根據所選用的細胞種類核對是否需要進行預雜交。
9.用雜交緩沖液作雜交。通常 IOOul 雜交緩沖液含有 1ul 探針。雜交前，將雜交緩沖液加熱至 95℃，然后立即放在冰上快速冷卻。于 50℃ 孵箱溫育至少 3 h, 也可溫育過夜。把培養皿放入一個密閉容器中，并放置濕濾紙以防雜交緩沖液的蒸發。加入足夠的雜交緩沖液以確保細胞被完全覆蓋，我們通常在每個培養孔加入 100ul 緩沖液。
10.2XSSC 簡單洗滌細胞 2 次，每次不超過 2 min。
11.嚴格洗滌。于 50℃ 用 2XSSC 和 50% 甲醜胺的混合液洗滌細胞 3 次，每次 20 min, 以去除細胞中未雜交的探針。如果背景仍然很高，可用 RNA 酶 A 處理（見步驟 12), 這樣能去除所有未雜交的探針。
12.(可選用）在 2XSSC 中加入 RNA 酶 A(100ng/ul, 溶于緩沖液 1) 處理細胞 25 min。隨后，進行嚴格洗滌（見步驟 11)。也就是說，如果選用 RNA 酶處理細胞，則需要在處理前、后各用 50% 甲酰胺和 2XSSC 混合液嚴格洗滌細胞 2 次。
13.2XSSC 洗漆 5 min。
14.緩沖液 1 洗漆，2X5 min。
15.TBSGT 緩沖液洗滌 15 min。
16.加入堿性磷酸酶交聯的抗地高辛抗體（用 TBSGT 緩沖液 1:500 稀釋)，室溫溫育 2 h 或 4℃ 過夜。
17.緩沖液 1 洗滌 2 次，每次 5 min。
18.緩沖液 2 洗滌 2 次，每次 5 min。
19.堿性憐酸酶的底物中溫育：在 1 ml 的緩沖液 2 中加入 4.5ulNBT 和 3.5ulBCIP。如神經元具有內源性堿性磷酸酶活性，加 10 一 lmol/L 左旋咪唑。每個培養皿中加入大約 0.5 ml 底物。溫育時間依照細胞中轉錄物的量調整，最短 15 min，長可過夜，應避光溫育。所用的堿性磷酸酶底物經催化生成深紫色的反應產物。如果需要熒光底物，可以使用堅固紅 TR(1.0 mg/ml, 溶于緩沖液 2) 或萘酚（0.4 mg/ml，溶于緩沖液 2)，通過熒光顯微鏡的羅丹明濾光片可以觀察到突光。
20.裸眼觀察到結果后，用 Tris-EDTA 緩沖液處理 15 min 以終止反應。
21.用重蒸（餾）水漂洗細胞。
22.用封片劑 aquamount 或甘油封片。
23.顯微鏡下觀察細胞
結果
我們利用原位雜交技術來研究編碼神經肽的 mRNA 在原代培養的椎實螺屬動物神經元的神經突起中的分布情況。我們感興趣的問題是轉錄物究竟是均勻分布在整個神經突起中，還是集聚在某一特定微小區域中。原位雜交實驗顯示該mRNA 在生長錐和曲張體處特別豐富（圖 3-1)
其他
具體材料
注意：所有的材料不應含有 RNA 酶，盡可能使用廠家已滅菌的塑料制品