基因互補實驗

實驗方法原理 
互補作用可以用來確定兩個突變是屬于同一基因還是屬于不同的基因。如果是同一基因內兩個不同位點的突變,它們就不能互補;如果是不同基因的突變則是互補的,此為基因間互補。有時同一基因內的兩個突變位點也能發生基因內互補,但基因內互補所恢復的酶活性一般最多只有野生型酶活性的25%,而基因間互補則為100%,因此基因間互補與基因內互補是可以區別的。具有基因內互補作用的基因產物是由幾個亞基(多肽鏈)組成的,這種互補作用是兩個不同結構變化的亞基互補而出現具有活性的蛋白質。盡管基因內互補是可以區別于基因間互補的,但互補測驗比較復雜。這種測驗復雜化的原因包括:①某些結構基因突變(包括轉座子插入突變)為極性突變。極性效應影響到突變基因隨后結構基因的產物量,這兩個基因的突變表型不能互相補償;②某些調節基因的超阻遏突變,如乳糖操縱子的調節基因is突變,它的突變和Z-Y-雙重突變的表型相同,is和z-、is和y-都不能互補,這些對互補結果的分析帶來一定的難度。
實驗材料 大腸桿菌
試劑、試劑盒 LB培養液無菌生理鹽水含鏈霉素、乳糖和色氨酸的基本培養基平板12皿乳糖EMB鏈霉素培養基平板16皿基本緩沖液250mlβ-ONPG溶液無菌小試管12支
儀器、耗材 恒溫水浴鍋 振蕩混合器 高壓滅菌鍋 分光光度計 三角瓶 移液管 培養皿
實驗步驟 
1.將供體菌和受體菌分別接入5ml LB培養液中,37℃振蕩培養過夜。

2.按表36-1的組合將供體菌與受體菌按1∶1進行混合于無菌試管中,置37℃輕搖30min。

3.將4組混合物分別稀釋至10-5;各取10-4、10-5稀釋液0.1ml分別涂布在含鏈霉素和色氨酸平板上,同時取供體菌和受體菌液0.1ml分別涂在以乳糖作為惟一碳源的基本培養基(含VB1)平板上作為對照,置37℃培養2d。

4.觀察平板上長出的菌落并計數。從4種互補實驗平板上各隨機挑選幾個菌落分別在EMB乳糖平板上畫線分離,將平板置于37℃培養2d。

5.觀察EMB乳糖平板上長出的菌落是否有分離現象。

6.將4種實驗菌株及EMB乳糖培養基上長出的互補菌落(共12株)分別接種在含乳糖的5mlLB液體中,置37℃振蕩培養過夜

7.過夜培養物經4000×g室溫離心10min,去上清液;用基本緩沖液洗滌菌體后制成懸浮菌液,調節細胞密度至OD600≈0.3。取1ml菌液,加1滴甲苯,立即振蕩10s,打開試管置37℃搖動40min以除去甲苯,然后在37℃水浴中按以下程序進行β-半乳糖苷酶的定量測定。

取1ml經上述處理的菌懸液,加入0.2ml β-ONPG(O-nitrophenylβ Dgalactoside鄰硝基苯,β D-半乳糖苷貯藏濃度為4mg/ml,溶液應為無色)輕輕搖動5min后再加入0.5mlNa2CO3(1mol/L)中止反應。取出反應混合物用分光光度計測定OD420值,比較各菌株的測定值。

注意事項 
進行互補測驗的菌懸液中細胞密度應保持低濃度,因為高濃度會導致重組發生。