所有的外肽酶作用的底物N-末端必須有1個游離的氨基，或者C-末端必須有1個游離的羧基，或者兩種結構都需要，而且，外肽酶從肽鏈末端水解1個肽鍵時，釋放的殘基不會多于3個。多肽末端的特定氨基酸、與肽鍵相鄰的氨基酸殘基的性質、多肽鏈的結構和長度共同決定外肽酶的活性。大多數氨肽酶的最適pH值在中性范圍，最適溫度介于37～50℃；與前者相比，羧肽酶具有較寬的作用pH值范圍(4.0～8.5)和較寬的溫度范圍(25～80℃)。
