多肽物質分離與分析方法研究（二）

1.2　親和層析(Affinity Chromatography,AC)
　　AC是利用連接在固定相基質上的配基與可以和其特異性產生作用的配體之間的特異親合性而分離物質的層析方法。自1968年Cuatrecasas提出親和層析概念以來，在尋找特異親和作用物質上發現了許多組合，如抗原-抗體、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸與其互補鏈等等。對多肽類物質分離目前主要應用其單抗或生物模擬配基與其親和，這些配基有天然的，也有根據其結構人工合成的。Patel等［13］人利用一系列親合柱分離純化到了組織血漿纖維蛋白酶原激活劑蛋白多肽。
　　固定金屬親和層析(Immobilized Metal Affinity Chromatography,IMAC)是近年來發展起來的一種親和方法。其固定相基質上鰲合了一些金屬離子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通過配為鍵鰲合側鏈含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特別是肽序列中含有His-X-X-X-His的結構最易結合到金屬離子親和柱上，純化效果較好［14］。其中胰島素樣生長因子(Insulin-Like Growth Factor,IGF)、二氫葉酸還原酶融合蛋白等均用此方法分離到純度較高的產品。
　　Chaiken等［15］人報道了另一種親和層析方法，利用反義多肽作為配基，這種多肽是由反義DNA表達產生，其與正鏈DNA表達產生的肽或蛋白具有一定的親和性，如Arg加壓素受體復合物，已用此法分離得到。DNA與蛋白、多肽復合物之間的作用也是生物親和中常用的方法。將人工合成的寡核苷酸結合在固定相基質上，將樣品蛋白或多肽從柱中流過，與之結合可達到分離特定結構多肽的目的。

1.3　毛細管電泳(Capillary electrophoresis,CE)――分離分析方法
　　CE是在傳統的電泳技術基礎上于本世紀60年代末由Hjerten發明的，其利用小的毛細管代替傳統的大電泳槽，使電泳效率提高了幾十倍。此技術從80年代以來發展迅速，是生物化學分析工作者與生化學家分離、定性多肽與蛋白類物質的有利工具。CE根據應用原理不同可分為以下幾種；毛細管區帶電泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)、毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)、毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)和膠束電動毛細管層析（Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)等。

1.3.1　毛細管區帶電泳(Capillary Zone electrophoresis,CZE)
　　CZE分離多肽類物質主要是依據不同組分中的化合物所帶電荷不同，且分離效果只由帶電性決定，比傳統凝膠電泳更準確。目前存在于CZE分離分析多肽物質的主要問題是天然蛋白或肽易與毛吸管硅膠柱上的硅醇發生反應，影響峰形與電泳時間，針對這些問題不少學者做了大量實驗進行改進，如調節電泳液的pH值，使與硅醇反應的極性基團減少；改進毛細管柱材料的組成，針對多肽性質的不同采取不同的CZE柱來分離。Issaq［16］等利用CZE方法研究分離5個含9個氨基酸殘基的小肽，確定了小肽分析的基本條件，即在低pH條件下，緩沖液中含有一定濃度的金屬離子如Zn2＋等，此時分離速度快而且準確。

1.3.2　毛細管等電聚焦電泳(Capillary Isoeletric Focusing,CIEF)
　　由于不同的蛋白、多肽的等電點（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的電泳槽中，其可在等電點pH條件下聚集沉淀下來，而與其他肽分離開來。CIEF在分離、分析混合多肽物質中應用不多，主要應用與不同來源的多肽異構體之間的分離，如對rHG不同異構體分離［17］。由于在CIEF柱表面覆蓋物的不穩定性限制了此法的廣泛應用。

1.3.3　毛細管凝膠電泳(Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
　　CGE是基于分子篩原理，經十二烷基磺酸鈉（SDS）處理的蛋白或多肽在電泳過程中主要靠分子形狀、分子量不同而分離。目前，又有一種非交聯、線性、疏水多聚凝膠柱被用于多肽類物質的分離分析，此電泳法適于含疏水側鏈較多的肽分離。這種凝膠易于灌注，使用壽命長，性質較為穩定。

1.3.4　膠束電動毛細管層析(Micellar Electrokinetic Electrophoresis Chromatography,MECC)
　　MECC的原理是在電泳液中加入表面活性劑，如SDS，使一些中性分子帶相同電荷分子得以分離。特別對一些小分子肽，陰離子、陽離子表面活性劑的應用都可使之形成帶有一定電荷的膠束，從而得到很好的分離效果。有文獻報道在電解液中加入環糊精等物質，可使含疏水結構組分的多肽選擇性與環糊精的環孔作用，從而利用疏水作用使多肽得到分離［18］。

1.4　多肽及蛋白質分離工程的系統應用
　　以上提到的分離多肽的技術在實際應用過程中多相互結合，根據分離多肽性質的不同，采用不同的分離手段。特別是在后基因組時代，對于蛋白質組［19］深入的研究，人們對于分離多肽及蛋白質的手段不斷改進，綜合利用了蛋白質和多肽的各種性質，采用包括前面提到的常規蛋白多肽提取方法，同時利用了高效液相色譜，毛細管電泳，2-D電泳等手段分離得到細胞或組織中盡可能多的蛋白多肽。在蛋白質組學研究中系統應用蛋白和多肽分離鑒定的技術是實現蛋白質組計劃的關鍵。其中電泳技術在此項研究中即是分離手段也是分析方法之一。特別是以下提到的質譜技術的發展，大大的提高了蛋白多肽類物質的分析鑒定的效率。

2　分析方法

2.1　質譜分析(Mass Spectrometry,MS)
　　MS在蛋白、多肽分析中已經得到了廣泛應用，特別是在分離純化后的在線分析中，MS的高靈敏性、快速性特別適合多肽物質分析鑒定。其中連續流快原子轟擊質譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB)和電霧離子化質譜(Electrospray Ionization,EIS)是近幾年發展起來的新方法。

2.1.1　連續流快原子轟擊質譜(Continuous-Flow Fast Atom Bombardment,cf-FAB）
　　cf-FAB是一種弱離子化技術，可將肽類或小分子量蛋白離子化成MH＋或（M-H）形式。主要應用于肽類的分離檢測，其具有中等分辨率，精確度大于±0.2amu，流速一般在0.5-15μl.mL-1。在測定使流動相需加0.5％～10％基質如甘油和高有機溶劑成分，使樣品在檢測探針處達到敏感化［20］。cf-FAB常與HPLC、CEZ等方法結合使用達分離分析的目的，許多多肽的cf-FAB分析方法已經建立，并得到很好的應用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。證明L-Pro在保持小肽構相穩定性，連接分子方面具有重要意義［21］。

2.1.2　電霧離子化質譜(Electrospray Ionization,EIS)
　　EIS可產生多價離子化的蛋白或多肽，允許相對分子質量達1×105的蛋白進行分析，分辨率在1500～2000amu,精確度在0.01％左右。EIS更適合相對分子質量大的蛋白質的在線分析，且需要氣化或有機溶劑使樣品敏感化。利用EIS與HPLC聯合分離分析GH和血紅蛋白均獲成功，其也可與CEZ聯合應用［22］。

2.1.3　基質輔助激光解析／離子化-飛行時間質譜(Matrix-associated laser dissociation/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)
　　MALDI-TOF是目前蛋白質鑒定中精確測定相對分子質量的手段，特別適合對混合蛋白多肽類物質的相對分子質量的測定，靈敏度和分辨率均較高。它是目前蛋白質組學研究的必備工具。同時結合液相色譜的聯用技術可以高效率的鑒定多肽物質。特別是當各種原理的質譜技術串聯應用時，不但可以得到多肽的相對分子質量信息，還可以測定它的序列結構，此項技術將在未來蛋白質組學研究中起到決定性作用［23］。

2.2　核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance,NMR)
　　NMR因圖譜信號的純數字化、過度的重疊范圍過寬（由于相對分子質量太大）和信號弱等原因，在蛋白、多肽物質的分析中應用一直不多。隨著二維、三維以及四維NMR的應用，分子生物學、計算機處理技術的發展，使NMR逐漸成為此類物質分析的主要方法之一。NMR可用于確定氨基酸序列、定量混合物中的各組分組成含量等分析中。但要應用于蛋白質分析中仍有許多問題需要解決，例如，如何使分子量大的蛋白質有特定的形狀而便于定量與定性分析，如何減少數據處理的時間問題等［24］。這些問題多有不少學者在進行研究。雖然在蛋白質分析中應用較少，NMR在分析分子中含少于30個氨基酸的小肽時是非常有用的，可以克服上述蛋白質分析中的缺點而達到快速準確分析的目的。

2.3　其他
　　除上述方法之外，氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、場解析質譜、IR、UV光譜、CD、圓而色譜、生物鑒定法、放射性同位素標記法及免疫學方法等都已應用于多肽類物質的結果鑒定、分析檢測之中。
　　以上簡要的介紹了近幾年多肽類物質分離、分析的常用方法及最新研究方向。隨著科學技術水平的不斷發展，會有許多更新的分離分析手段不斷涌現，因此這一領域的研究具有廣闊的前景。