多重等位基因特異性PCR芯片在聽力篩查中的應用

　　We demonstrate a new method, using a universal array approach termed multiplex allele-specific PCR-based universal array (ASPUA), and applied it to the mutation detection of hereditary hearing loss. Mutations in many different genes may be the cause of hereditary hearing loss, a sensory defect disorder. Effective methods for genetic diagnosis are clearly needed to provide clinical management. Owing to the broad genetic basis of this condition, clinical assay of such a highly heterogeneous disorder is expensive and time consuming. In ASPUA, the allele discrimination reaction is carried out in solution by multiplex allele-specific PCR and a universal solid phase array with different tag probes is used to display the PCR result. The purpose of developing the ASPUA platform was to utilize the rapidity and simplicity of the amplification refractory mutation system (ARMS) with the detection power of microarray hybridization. This is the first report of the combination of these two technologies, which allow for the completion of allele-specific detection of 11 of the most frequent mutations causing hereditary hearing loss in under 5 hr. The ASPUA platform was validated by accurately analyzing 141 patient samples that had been previously genotyped for GJB2, GJB3, SLC26A4, and MTRNR1. In addition, we also developed a simplified assay by using streptavidin-coated magnetic beads instead of fluorescence for signal display that can be assessed through a conventional light microscope. We demonstrate that the ASPUA platform is rapid, cost-effective, and easily-used, and is especially appropriate for mutation detection in clinical genetic diagnostics.

　　本文利用多重等位基因特異性PCR與通用芯片技術相結合（allele-specific PCR-based universal array，ASPUA）建立了一種新方法，并將其應用于遺傳性耳聾基因突變檢測。遺傳性耳聾是一種感音性耳聾，位于多個不同基因上的突變均可導致該病，臨床亟需有效的基因診斷方法。由于該病的遺傳背景比較復雜，用于這種高異質性遺傳病的基因檢測方法不但昂貴而且耗時。而ASPUA方法，將等位基因辨別反應通過多重等位基因特異性PCR在液相中實現，然后利用固定了不同標簽（Tag）探針的固相通用芯片將PCR結果展現出來。ASPUA平臺的建立利用了擴增阻滯突變系統快速、簡便的特點，與微陣列雜交方法高通量的特性，這是首次將這兩種技術相結合的報導。應用該技術可在5小時之內完成導致遺傳性耳聾的11種常見基因突變的檢測。采用該技術已經精確分析了141份樣品，這些樣品是已經進行了GJB2，GJB3，SLC26A4和MTRNR1基因型分析的臨床樣品。除此之外，我們還建立了一種簡化的方法，該方法采用鏈霉親和素包被的磁珠代替熒光作為信號指示劑，可使用常規的光學顯微鏡對結果進行分析。綜上，本文所建立的ASPUA方法是一個快速，經濟，易用的檢測平臺，尤其適用于臨床遺傳檢測的基因突變檢測。

　　（以下為摘錄的部分翻譯內容）

　　已經作過分型的病人DNA樣品分別由下列單位提供：中國人民解放軍總醫院，中國醫學遺傳學國家實驗室；Thomas Jefferson大學；斯坦福大學醫學院；布拉格Charles大學。

　　靠近5’端有15個堿基的多聚T序列、并且5’-端用氨基標記的探針被共價連接到醛基表面修飾過的玻璃基片（中國北京，博奧生物有限公司，以下簡稱博奧生物）上，用來捕獲等位基因特異性的PCR產物。每種探針使用50%DMSO配制為15μM的濃度，使用SmartArrayer? 48微陣列點樣儀（博奧生物）以5個重復點的形式點制為微陣列芯片，其點徑為約150μm，點間距為300μm。

　　多重等位基因特異性PCR被分開在兩管中進行以避免某些引物對之間的相互作用。四個位點：c.35delG，c.547G>A，c.2168A>G，c.919-2A（IVS7-2A>G）同時在一管中進行擴增。其他的七個位點在另外一管中進行擴增。模板用量為50ng基因組DNA或者5pg質粒DNA。每對引物的濃度均獨立地進行了優化。采用不對稱PCR用以獲得足夠雜交使用的單鏈DNA。每次實驗均包括一個PCR陰性質控（不加模板）。由于針對兩個等位基因的引物都被加入反應體系，即使是純合子至少其中一個等位基因的產物也必定會擴增出來，所以沒有引入額外的PCR陽性質控。

　　將兩管擴增反應產物混合起來。取5微升混合物，加入10微升雜交液。98攝氏度加熱2分鐘，在冰上冷卻后移至芯片的子陣上，50攝氏度溫育1小時，清洗兩次（每次2分鐘）。最后離心甩干。

　　使用商業微陣列芯片掃描儀和軟件檢測結果，取微陣列上每點信號的絕對中位信號強度（AMSI，信號強度中位值減去背景強度中位值的差值），使用最小值1000作為閾值。為了排除引物二聚體所造成的假陽性結果，一個等位基因的絕對中位信號強度必須比該等位基因的陰性質控大10倍以上。如果以上條件都滿足，該等位基因的信號值則被記為陽性。

　　圖1 ASPUA的原理。A：多種等位基因特異性PCR分兩管進行（2.5小時）。進行不對稱擴增以產生足夠的單鏈標記DNA用以雜交和檢測。B：變性之后，PCR產物與通用芯片進行雜交（1小時）。C：清洗過的芯片使用掃描儀進行檢測。通過圖像分析獲得多個位點的基因分型結果（0.5小時）。

　　圖1簡明地概括了多重ASPUA的原理。使用熱啟動DNA聚合酶進行多重等位基因特異性PCR，然后PCR產物用來與通用芯片上的捕獲探針進行雜交。用信號強度和標記探針在芯片上結合的位置來判讀結果。對于每個位點，使用兩個在3’端堿基不同的等位基因特異性引物來區分不同的等位基因。所使用的熱啟動DNA聚合酶缺乏3’-5’外切酶活性，因此如果PCR引物在其3’端與模板發生錯配的話其擴增效率會大大降低。一個標記過的通用引物用來增加單鏈DNA。在ASPUA檢測中，通用芯片扮演著顯示之前擴增結果的解碼工具的角色。該通用芯片之前已被驗證能夠保證雜交結果的特異性。

　　圖2A顯示了芯片的格式，其中QC和BC分別為點樣效率的陽性和陰性質控，PC和NC為充當雜交陽性和陰性質控的寡核苷酸。PC為雜交體系中一種TAMRA標記的寡核苷酸的反義序列，而NC則與雜交體系中任意一種序列都不互補。微陣列芯片上子陣中的其他點均為用以捕獲ASPUA方法PCR產物的標記探針。

　　為了證實等位基因特異性探針是否只擴增所期望的目標等位基因，以及這些突變的不同等位基因是否可以被特異地分辨出來，使用一個純合子DNA樣品作為模板和所有引物進行了擴增。僅有期望的目標等位基因被擴增出來。對于那些我們無法找到純合子病人樣品的突變，使用單個等位基因構建的質粒克隆來代替。

　　如圖2B所示，只有正確的引物所對應的標記產生了明顯的信號。每個突變體基因模板都產生了特異的信號。表1顯示了特異性實驗中5次重復試驗的絕對中位數信號強度和標準差SD數據。5次重復試驗中的所有陽性信號都滿足材料與方法中所提出的兩項標準。

 

表1 特異性研究中的絕對中位值信號強度和標準差數據

 

　　圖2 ASPUA方法的特異性。A：每個探針均以五個重復點的形式排列。QC和BC為點樣的陽性和陰性質控，PC和NC為雜交的陽性和陰性質控。其他的點均為各等位基因的捕獲探針。數字代表11個突變的名稱，分別（依次）為：c.34delG，c.167delT，c.176_191del16，c.235delC，c.299_300delAT，c.538C>T（p.Arg180X），c.547G>A（p.Glu183Lys），c.707T>C（p.Leu236Pro），m.1555A>G，c.2168A>G（p.His723Arg）和c.919-2A>G。W和M分別指示野生型和突變型。B：雜交試驗的圖像。P代表分子克隆方法構建的基因模板，hom表示純合子（但對于m.1555A>G突變，hom代表分子克隆方法構建的基因模板）

　　在等位基因特異性引物3’端人工引入的錯配堿基可以增強選擇性雜交的特異性。降低引物的濃度也可以提高本方法的分辨能力，但是這兩種方法的效率在PCR反應條件的一定范圍內是不同的。為了研究這些效果，選擇了m.1555A>G突變的野生型引物作為檢測的目標，因為其在3’端具有一個T殘基而常常具有較差的分辨能力。人工錯配堿基被引入到從3’端算起的第3，5，9個殘基位置（記為m.1555A>G-W3，-W5，和-W9）。由于發生在野生型引物和突變型靶序列之間的T-G錯配，天然的野生型引物的分辨能力（DR）較低。減小引物的濃度可以增加特異性，但是這種方法也大大降低了擴增效率。相反，出現在引物3’端的人工錯配在增加分辨能力的同時對擴增效率的影響很小。當人工錯配位置逐漸遠離3’端位置的時候，特異性逐漸下降。M.1555A>G-W3引物在突變模板數量增加、以及磁珠用量增大的條件下保持了高分辨能力。總而言之，m.1555A>G-W3引物在較寬的PCR條件范圍內都表現良好。

　　已經預先分型的141份正常人和病人DNA樣品得到了檢測。ASPUA檢測到的基因分型結果和這些樣品的臨床信息列在增補表2中。在141份受測樣品中，122份樣品來自耳聾病人，9份來自攜帶者。有1位被發現是m.1555A>G純合子，但是沒有表現出臨床癥狀。9份來自普通人對照的樣品未發現變異。

　　為了評估ASPUA方法所需要的最低樣品量，我們使用了一種野生型基因組DNA的不同數量用于檢測。表2種列出了5次重復試驗得到的絕對中位數信號強度和標準差數據。絕對中位數信號強度隨著目標數量減少而下降。在使用25ng基因組模板時，所有位點的絕對中位數信號強度值都在1000以上。然而在10ng水平時，有四個位點降到1000之下。我們發現使用多重置換擴增（MDA）技術可以擴展ASPUA的檢測靈敏度。

 

表2 靈敏度研究中的絕對中位值信號強度和標準差數據

　　這里，我們結合多重等位基因特異性PCR和通用芯片（ASPUA），提出了一種用于同時檢測導致遺傳性聽力損失的11種突變的、快速、經濟的方法。這些突變，不管是僅有一個堿基突變的還是由長達16個堿基缺失的，都能夠被精確地識別出來。該方法的特異性已用純合子DNA進行了驗證。酶促反應和通用芯片雜交的特異性保證了整個過程的高分辨能力。盡管某些突變位置接近，例如GJB3基因上相差僅9個堿基的兩個位點，該方法都能夠準確地檢測。

　　在病例研究中，我們測試了141份樣品來驗證ASPUA方法的準確性。全部樣品的結果與提供樣品的實驗室原先所作的基因分型結果均完全一致。由于病例DNA樣品來自于不同的實驗室，DNA的質量在一定程度上存在差異。但是這種差異并沒有影響到檢測的結果，而且所有的陽性結果都達到了檢測標準。有1份樣品被發現攜帶m.1555A>G突變，但是病人尚未表現出臨床癥狀。這樣的病人，氨基糖甙類抗生素應該被禁用以避免誘發耳聾。在準備本文手稿的同時，我們應用ASPUA對多達515份病人樣品進行了檢測，其結果與直接測序完全一致。

　　我們正在計劃研發第二代遺傳性耳聾檢測微陣列芯片，并增加ASPUA方法檢測的突變種類。我們已經證實將擴增反應分開到不同的管中使用互相兼容的引物組合和熱啟動DNA聚合酶進行可以達到充分的擴增效率，即使是在DNA的品質和數量有所差異的情況下。增加反應管的數目以檢測更多的等位基因以及位點是最簡單的方法，而且將一些新的基因位點增加到每個反應管中也可以馬上被測試，如果擴增效率保持在高水平，則可以采納。我們也證實原來雜交效率低下的等位基因，可以通過在3’端人工引入錯配堿基大大改善其效果。這項方法可以用來對任意新增的非最優條件的等位基因進行測試。

　　ASPUA方法簡便易用。雖然目前它的通量不是很高，但是很容易擴展。其他的耳聾基因分析平臺采用了各種不同的途徑。Siemering等提出的等位基因特異性寡核苷酸生物芯片從PCR到結果解釋需7步操作，1天時間。Gardner等提出的APEX方法使用6步操作在6小時內完成，但是需要用到多通道的掃描儀和四色的多重熒光標記，從而增加了可觀的成本。反觀現在的ASPUA方法，可以在一張具有四個子陣列的芯片上同時完成4個樣本的檢測。整個過程可在5小時內分4步完成：DNA提取（1小時），PCR（2.5小時），雜交（1小時），掃描和自動結果判讀（0.5小時），避免了純化擴增產物和其他一些繁瑣的步驟。還可以在僅稍微增加耗時的情況下處理更多的樣品。如果使用12張具有4個子陣列的芯片對48個樣品進行檢測，總耗時僅增加40分鐘用于樣品處理。

　　雖然DNA測序可以獲得完整的基因分型數據，并且與ASPUA方法一樣迅速，但其設備成本卻數倍與本技術。另外，傳統的RFLP或者斑點印跡等位基因寡核苷酸（ASO）方法，都會隨著檢測突變的種類或者檢測樣品數目的增多而使勞動強度大大增加。在ASPUA方法中，PCR產物可以直接用于雜交而不必進行純化，也不必插入標記有染料的ddNTP，從而節省成本。通用芯片可以適用于不同的檢測，從而也降低了成本。

　　綜上所述，我們將等位基因特異性PCR與通用微陣列芯片技術結合起來，創造了一種用于對導致遺傳性聽力損失的基因突變進行檢測的方法ASPUA。等位基因特異性PCR的特異性和簡單性保證了基因分型結果的高準確性。對于常規診斷實驗室，ASPUA具有一些獨特的優點。現在，我們應用它對11種突變進行多重檢測。ASPUA通用芯片使得多重檢測具有高度的靈活性，而且基因位點的數目還可以增加。微陣列芯片的格式還可以被重新設計，用以在一張芯片上同時檢測更多的樣品。