由于臨床表現無特異性，確診有賴于病原學和血清學診斷。
孕婦感染巨細胞病毒有兩種情況，一種初次感染，即孕婦在懷孕期間第一次發生感染，感染在整個孕期任何時間都有可能發生。另一種情況是復發性感染，指孕婦在懷孕之前已經感染了病毒，當初癥狀輕微或沒有癥狀，但病毒潛伏在體內，當女性懷孕后機體的抵抗力下降，潛伏的病毒會再度活躍繁殖，就出現了復發性感染。
先天性巨細胞病毒感染的診斷，除根據孕婦感染巨細胞病毒史和患兒的臨床表現外,主要根據實驗室檢查結果確診。若為宮內感染，出生時從新生兒尿液或腦脊液中能檢出巨細胞病毒包涵體，或從臍血或新生兒血中檢測出巨細胞病毒IgM，具有診斷價值。若為產道感染，至少于生后2周方能從新生兒尿液中檢出巨細胞病毒包涵體。此外，新生兒尿液、胃液、腦脊液沉渣作涂片并染色后，在光鏡下查到巨大細胞內含典型嗜酸性核內包涵體，同樣具有診斷價值。