當臨床癥狀提示本病時，需做實驗室檢查確定診斷。尿中分支酮酸的過篩檢查可用三氯化鐵試驗（綠灰色為陽性）和二硝基苯肼試驗（黃色沉淀為陽性）。可用紙層析或柱層析法測定血和尿中分支氨基酸增多。可用薄層層析法或氣相色譜法測定酮酸。酶活性的測定可用白細胞或皮膚成纖維細胞，典型病例不能將14C標記的亮氨酸變為14CO2，酶活性為正常的0～2%，間歇型為8%～16%，輕型介于兩者之間，B1有效型為正常的25%以上。雜合子的酶活性為正常的50%。用經培養的羊水細胞測定酶活性可做出產前診斷。
早期診斷可根據家族史及生物化學檢查在典型癥狀出現前作出，這樣可以避免不可逆的腦損傷。用羊水穿刺、羊水細胞培養、酶活性測定等方法可對某些氨基酸代謝紊亂作產前診斷，以決定是否中止妊娠。