定量蛋白質組學方法獲得了泛素化分布和動態變化信息的介紹

泛素化是真核生物特有的翻譯后修飾，在哺乳動物細胞中，泛素化靶向～100,000 個位點，并由約640種泛素化酶和約90種去泛素化酶可逆調控。盡管目前泛素化已被廣泛關注和研究，但對蛋白質特定位點的泛素化比例（占有率）進行量化的研究卻很少。因此本文主要通過定量蛋白質組學方法，量化了人類細胞中蛋白質組范圍內的泛素化位點占有率和泛素化修飾的半衰期。

為了系統地量化泛素化的位點特異性占有率，作者采用了連續稀釋SILAC（Serial Dilution SILAC, SD-SILAC）的方法對HeLa細胞進行定量。該方法的原理如下：泛素化修飾的蛋白在trypsin酶切后會余下Lysine側鏈（ε-氨基）-Glycine-Glycine的殘留修飾，該修飾可以通過抗體富集并被串聯質譜檢測鑒定。基于該機制作者首先對輕重標SILAC細胞分別用NHS-GG-Boc標記lysine側鏈，其中H為低濃度的部分化學修飾（Partial Chemical modification，PC-GG），L為高濃度的全局性化學修飾（Comprehensive Chemical modification，CC-GG），通過在H組中摻入已知比例的L組，并對抗體富集Lysine-ε-Glycine-Glycine后的混合蛋白質組進行標記，即可獲得準確的PC-GG值；隨后在第二步定量中，作者在天然的未標記L蛋白質組中摻入已知比例的PC-GG H蛋白質組，trypsin酶切抗體富集后利用第一步的PC-GG值和第二次定量的H/L ratio即可獲得位點的天然泛素化占有率。

通過上述實驗，作者定量到了上萬個泛素化位點，并得知細胞中天然泛素化位點占有率的中位數僅0.0081%，作者還將該比例與細胞中其他翻譯后修飾進行比較，發現泛素化修飾水平比磷酸化等高修飾率的翻譯后修飾低了近3個數量級。說明泛素化修飾的位點雖然很多，但其修飾率極低。作者還量化了泛素化修飾的半衰期，發現大多數泛素化修飾半衰期在30分鐘以下，壽命遠小于mRNA和蛋白質，說明泛素化修飾在細胞中是高度動態變化的。

隨后，作者還嘗試探究了去泛素化過程中蛋白酶體活性的影響，向SILAC細胞中添加靶向泛素活化酶和靶向蛋白酶體的小分子抑制劑（TAK-243和MG-132）進行定量檢測，定量結果顯示即使蛋白酶體活性減弱，蛋白酶體定向底物的去泛素化仍可能發生，這種解偶聯允許泛素在蛋白酶體受損的細胞中循環，可能有助于維持泛素化的信號傳導功能，并減輕蛋白酶體受損引起的蛋白毒性應激。最后作者對泛素化修飾位點進行GO分析，發現修飾比例較高的位點主要集中在質膜和跨膜轉運蛋白中，且在同一跨膜蛋白中細胞質一側結構域上更為集中。

總的來說，本文通過定量蛋白質組學方法，系統地獲得了泛素化分布和動態變化信息，為泛素化修飾的生物功能及作用機制等研究提供了新的方向。