小型連續發酵實驗

實驗方法原理 在分批培養中，一次加入所有的培養基，不予補充，不再更換。隨著微生物的活躍生長，培養基中營養物質逐漸消耗，有害代謝產物不斷積累，細菌的對數生長期不可長時間維持。如果在培養器中不斷補充新鮮營養物質，并及時不斷地以同樣速度排出培養物(包括菌體及代謝產物)，理論上講，對數生長期就可無限延長。只要培養液的流出量能使分裂繁殖增加的新菌數相當于流出的老菌數，就可保證培養器中總菌量基本不變。連續培養方法的出現，不僅可隨時為微生物的研究工作提供一定生理狀態的實驗材料，而且可提高發酵工業的生產效益和自動化水平。

實驗材料 大腸桿菌

試劑、試劑盒 牛肉膏蛋白胨培養基葡萄糖NaClNa2HPO4 (NH4)2SO4

儀器、耗材 連續培養裝置

實驗步驟

一、實驗主要儀器設備和材料

簡單連續培養裝置（見圖1）

菌種：大腸桿菌（E. Coli）；

培養基：基本培養基：牛肉膏蛋白胨培養基；

發酵培養基：葡萄糖，NaCl，Na2HPO4， (NH4)2SO4。

二、實驗方法、操作步驟

1.  還原糖的測定：3,5－二硝基水楊酸比色法測定（具體操作步驟見實驗淀粉酶的固態發酵實驗）

2.  蛋白質濃度的測定：考馬斯亮藍染色法

3.  大腸桿菌的增殖曲線測定（具體操作步驟見實驗細菌增殖曲線的測定）

大腸桿菌接種于母種培養基，在37 ℃培養6 h，將培養液在3 000 rpm離心10 min，傾去上清液，加入無菌的生理鹽水，成均勻液，細胞數為107個/ml，接種于發酵培養基，在相同條件下進行培養，并每隔一定時間進行取樣，用無菌的相同培養液作為對照組，將上述菌液于600 nm波長比色（要求消光度在0.3-0.6間，如果超過用未接種的培養液適當稀釋），然后將培養液在紅外線烘箱110-120 ℃內烘干至恒重，以菌懸液OD值為縱坐標，相對應的菌體濃度為橫坐標，繪制直線，求出斜率1/K。

K＝生物量/OD值

4.  制備好的發酵培養液倒入2 L的三角瓶中。用棉塞固定玻璃管，玻璃管上端接內徑3 mm、外徑5 mm的橡皮管。用彈簧夾夾住，滅菌備用。

5.  滅菌后冷卻至30 ℃的三角瓶安裝于恒溫水浴中培養。

6.  將大腸桿菌培養液以10％的接種量接入三角瓶中，先進行攪拌間歇式培養，若有無菌空氣導管，也可通氣攪拌培養。

7.  將補料用的3 L培養基裝在3 L的三角瓶中，將送料的橡皮管的一端插入，用棉塞固定，另一端用油紙包好，滅菌備用。

8.  定時取出測定間歇培養的菌液濃度，以求出增殖速度。

μ=dx/xdt

?μt=dx/x

?μ(t2－t1)=ln(x2/x1)

?μ= (lnx2－ln x1)/ (t2－t1)

9.  取下輸液用的橡皮管，剝去牛皮紙紙，與蠕動泵進液口相接，將培養器的輸液橡皮管接到蠕動泵出液口。

10.  據菌體增殖速度，以較小稀釋率開始流加培養基，此時稀釋率須小于此增殖率。

F≤μ?F≤(lnx2－ln x1)/ (t2－t1)  

三、實驗結果  

1.  將測定的OD600值及相應的生物量填入下表。

2.  繪制大腸桿菌連續發酵過程中的還原糖、蛋白質濃度和生物量的時間曲線(注明何時補料)。