小量培養物中分離BACDNA

限制性內切核酸酶大腸桿菌

乙醇異丙醇DNA提取液堿性裂解液STE溶液TE

脈沖場凝膠電泳儀LB 培養基DNA 標準參照物Sorvall SS-34 轉頭或同類產品層析樹脂

一、材料

1. 緩沖液和溶液

乙醇

異丙醇

DNA提取液

堿性裂解液Ⅰ，預冷

堿性裂解液Ⅱ

堿性裂解液Ⅲ，預冷

STE溶液，預冷

TE ( pH 8.0)

2. 酶和緩沖液

限制性內切核酸酶

3. 凝膠

脈沖場凝膠電泳儀

4. 培養基

含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基

5. 核苷酸與寡核苷酸

脈沖場凝膠電泳所需的 DNA 標準參照物

6. 離心機與轉頭

Sorvall SS-34 轉頭或同類產品

7. 專用設備

層析樹脂

8. 載體和菌株

BAC 轉化的大腸桿菌

二、方法

1. 用 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培養基培養 BAC 轉化的大腸桿菌，37℃ 劇烈振搖過夜。

2. 4℃ 下，2000 g ( 用 Sorvall SS-34 轉頭，4100 r/min ) 離心 5 min, 收集細菌。小心棄去培養液，用吸頭吸凈殘液。

3. 在每個離心管中加 5 ml 預冷的 STE，用移液器吹懸細菌沉淀。按步驟 2 離心收集細菌。

4. 將細胞重懸于 200 μl 冰冷的堿性裂解液Ⅰ中。將細胞轉移至預冷的微量離心管中，置于冰上。

5. 向管中加入 400 μl 新鮮配制的堿性裂解液Ⅱ。輕輕將蓋緊的離心管翻轉數次。將離心管置于冰上。

6. 向管中加入 300 μl 冰冷的堿性裂解液Ⅲ，輕輕將蓋緊的離心管翻轉數次。將離心管置于冰上 5 min。

7. 在微量離心機上以最大速度 4℃ 離心 5 min，除去細胞碎片沉淀。將上清移入一新的微量離心管中。室溫下加入 900 μl 異丙醇，輕輕翻轉數次離心管，混勻。

8. 立即在微量離心機上室溫下以最大速度離心 5 min，使核酸沉淀。棄去上清，用 1 ml 70% 乙醇小心漂洗沉淀。室溫下離心 2 min，吸去乙醇。在室溫下干燥沉淀 5~10 min。將濕沉淀溶于 50 μl TE ( pH 8.0) 中。

9. 用限制性內切核酸酶消化 BAC DNA。

10. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。電泳要采用大小適合的 DNA 標準參照物。