層析技術的應用（五）

（四）親和層析法　　

親和層析是利用待分離物質和它的特異性配體間具有特異的親和力，從而達到分離目的的一類特殊層析技術。

具有專一親和力的生物分子對主要有：抗原與抗體、DNA與互補DNA或RNA、酶與它的底物或競爭性抑制劑、激素（或藥物）與它們的受體、維生素和它的特異結合蛋白、糖蛋白與它相應的植物凝集素等。可親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶性載體相連作為固定相吸附劑，當含有混合組份的樣品通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質，才能被固定相吸附結合，其它沒有親和力的無關組份就隨流動相流出，然后改變流動組成份，將結合的親和物洗脫下來。親和層析中所用的載體稱為基質，與基質共價連接的化合物稱配基。

親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩定的活性物質尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩定條件，因此親和層析的應用范圍受到了一定的限制。

親和層析可用于純化生物大分子：稀溶液的濃縮；不穩定蛋白質的貯藏；從純化的分子中除去殘余的污染物；用免疫吸附劑吸附純化對此尚無互補配體的生物大分子；分離核酸是親和層析應用的一個重要方面。

應用實例：2-胰凝乳蛋白酶的提純

⒈親和吸附劑（Σ-氨基-N-乙酰-Ｄ-色氨酸）的制備 取一定體積的Sepharose4B加100mgCNBr。攪拌混合物，滴加2-8mol/L NaOH，使溶液pH維持在11.0。20℃左右，8-12分鐘完成反應。在布氏漏斗中抽濾活化的瓊脂糖，然后用20倍體積冷的0.1mol/L NaHCO3（pH9.0）溶液洗滌。將上述活化的Sepharose4B與等體積0.1mol/L NaHCO3（pH9.0并在冰箱中預冷）溶液混合，接著迅速加入α-胰蛋白酶抑制劑（Σ-氨基-N-乙酰-色氨酸甲酯）。抑制劑的最大用量為每毫升Sepharose 4B 65μmol/L。4℃緩慢攪拌約24小時，而后再用水和緩沖液反復地洗至沒有游離的抑制劑為止。制得的親和吸附劑在50mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）中保存備用。

⒉分離 親和吸附劑裝柱后用50mmol/L Tris-HCl（pH8.0）緩沖液平衡（室溫）。樣品溶于同樣緩沖液中并上柱，再應用同樣緩沖液淋洗柱子。流速為30-60ml/小時，直至280nm無光吸收時停止洗滌，然后改用0.2mol/L醋酸緩沖液（pH3.0）洗脫。