微生物的誘發突變實驗

實驗方法原理

紫外線（UV）是一種最常用的物理誘變因素，它的主要作用是使 DNA 雙鏈之間或同一條鏈上兩個相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，阻礙雙鏈的分開、復制和堿基的正常配對，從而引起突變。紫外線照射引起的 DNA 損傷，可由光復活酶的作用進行修復，使胸腺嘧啶二聚體解開恢復原狀。因此，為了避免光復活，用紫外線照射處理時以及處理后的操作應在紅光下進行，并且將照射處理后的微生物放在暗處培養。

實驗材料 枯草芽孢桿菌 BF7658

試劑、試劑盒 無菌生理鹽水淀粉培養基碘液

儀器、耗材 顯微鏡紫外線燈（15 W）磁力攪拌器玻璃涂棒血細胞計數板

實驗步驟

1. 菌懸液的制備

1.1 取培養 48 h 生長豐滿的枯草芽孢桿菌 BF7658 斜面 4～5 支。用 10 ml 左右的無菌生理鹽水將菌苔洗下，倒入一支無菌大試管中，將試管在振蕩混合器上振蕩 30 s，以打散菌塊。

1.2 將上述菌液離心（3000 r/min，10 min）， 棄去上清液，用無菌生理鹽水將菌體洗滌 2～3 次，制成菌懸液。

1.3 用顯微鏡直接計數法計數，調整細胞濃度為 103 個/毫升。

2. 平板制作

將淀粉瓊脂培養基融化，倒平板 27 套，凝固后待用。

3. 紫外線處理

3.1 將紫外線開關打開預熱約 20 min。

3.2 取直徑 6 cm 無菌平皿 2 套，分別加入上述調整好細胞濃度的菌懸液 3 ml，并放入一根無菌攪拌棒或大頭針。

3.3 將上述 2 套平皿先后置于磁力攪拌器上，打開板蓋，在距離為 30 cm，功率為 15 W 的紫外燈下分別攪拌照射 1 min 和 3 min。蓋上皿蓋，關閉紫外燈。

照射計時從開蓋起，加蓋止。先開磁力攪拌器開關，再開蓋照射，使菌懸液中的細菌接受照射均等。操作者應戴上博利眼鏡，以防紫外線傷眼晴。

4. 稀釋

用 10 倍稀釋法把經過照射的菌懸液在無菌水中稀釋成 10-1～10-6。

5. 涂平板

取 10-4、10-5 和 10-6 三個稀釋度涂平板，每個稀釋度涂 3 套平板，每套平板加稀釋菌液 0.1 ml 用無菌玻璃涂棒均勻地涂滿整個平板表面。以同樣的操作，取未經紫外線處埋的菌液稀釋涂平板作為對照。

從紫外線照射處理，直到涂布完平板的幾個操作步驟都需在紅燈下進行。

6. 培養

將上述涂勻的平板，用黑色的布或紙包好，置 37℃ 培養 48 h。注意每個平板背面要事先標明處理時間和稀釋度。

7. 計數

將培養好的平板取出進行細菌計數。根據對照平板上 cfu 數，計算出每毫升菌液中的 cfu 數。同樣計算出紫外線處理 1 min 和 3 min 后的 cfu 數及致死率。

8. 觀察誘變效應

選取 cfu 數在 5～6 個左右的處理后涂布的平板觀察誘變效應：分別向平板內加碘液數滴，在菌落周圍將出現透明圈。分別測量透明圈直徑與菌落直徑并計算其比值（HC 比值）。與對照平板相比較，說明誘變效應，并選取 HC 比值大的菌落移接到試管斜面上培養。此斜面可作復篩用。