我國科學家揭示CART細胞觸發細胞因子釋放綜合征機制

　　盡管用經過基因改造后表達嵌合抗原受體（CAR）的T細胞（CAR-T細胞）治療B細胞惡性腫瘤的臨床應用取得了成功，但是細胞因子釋放綜合征（CRS）卻阻礙了這種療法在患者中的有效性。眾所周知，CRS是由急性炎癥反應觸發的，其特征是發燒、低血壓和與血清細胞因子升高有關的呼吸功能不全。盡管人們已報道在經過CAR-T細胞治療的人源化小鼠模型中，巨噬細胞參與了CRS的發病機制，但觸發CRS的機制尚不清楚。輸注到患者體內的CAR-T細胞經歷活化和增殖，快速增殖的CAR-T細胞可能會在短時間內導致B白血病細胞迅速大量死亡。巧合的是，急性淋巴細胞白血病（ALL）患者的疾病負擔也與CRS的發生率和嚴重程度密切相關。如此大規模的惡性B細胞死亡參與CRS發病機制的方式仍不明確。

　　細胞可以經歷不同類型的死亡。細胞凋亡最初被認為是唯一的受到調控的程序性死亡形式。但是，近期研究已證實了一種以前未被識別的程序性壞死，其特征是細胞快速腫脹、質膜上出現較大的氣泡以及促炎因子釋放。至少已鑒定出兩種程序性壞死細胞死亡途徑，包括MLKL介導的壞死性凋亡（necroptosis）和GSDMD（Gasdermin D）或GSDME（Gasdermin E）介導的細胞焦亡（pyroptosis）。

　　將RIPK1招募到TNF-α受體上可與RIP3形成一種死亡復合物，隨后產生膜納米孔，從而導致壞死性凋亡。不同于MLKL的是，GSDMD或GSDME由炎性半胱天冬酶（caspase 1、caspase 4、caspase 5和小鼠caspase 11）或caspase 3激活，可形成插入到細胞膜中的寡聚物而形成納米孔，因而介導細胞焦亡。

　　在一項新的研究中，來自中國醫學科學院、鄭州大學、華中科技大學和北京大學的研究人員提供的證據表明，人類B白血病細胞和其他靶腫瘤細胞表達了足夠數量的GSDME，所表達的GSDME可被由CAR-T細胞釋放的顆粒酶B激活的caspase 3高效激活，從而導致靶細胞遭受細胞焦亡。細胞焦亡釋放的因子刺激巨噬細胞產生促炎性細胞因子，這很可能觸發接受CAR-T細胞治療的患者中發生的CRS。相關研究結果發表在2020年1月17日的Science Immunology期刊上，論文標題為“Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome”。

圖片來自Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969。

　　這些研究人員發現CAR-T細胞由于釋放大量穿孔素和顆粒酶B而激活了B白血病細胞中的caspase 3-GSDME途徑，從而導致細胞焦亡和隨后的CRS。已觀察到CAR-T細胞經歷增殖過程并在體內的某個時間點達到極高的增殖頻率。因此，在相對較短的時間內，大多數靶細胞可能會經歷細胞焦亡，導致受到激活的巨噬細胞通過活化的caspase 1產生IL-6和IL-1β，從而觸發CRS。闡明這種分子機制為CRS嚴重程度與CAR-T細胞在治療期間的數量和B白血病細胞負荷有關的臨床觀察提供了深刻的見解。

　　在人類B白血病細胞、MCF-7乳腺癌細胞和小鼠B16黑色素瘤細胞中檢測到GSDME表達是出乎意料的，這是因為它作為一種孔形成蛋白發揮作用，而且它的激活是潛在危險的，并且可能導致細胞死亡。據報道，GSDME在許多檢測到的腫瘤細胞系中不表達。與此相一致的是，GSDME基因的啟動子區域顯示出高甲基化狀態，這就表明GSDME基因在細胞中遭受表觀遺傳沉默。 GSDME被認為是一種通過caspase 3裂解誘導程序性細胞死亡的腫瘤抑制基因，并且腫瘤細胞可能已進化出表觀遺傳學手段來沉默GSDME表達，從而允許腫瘤發生。然而，GSDME在B白血病細胞和其他腫瘤細胞中的高表達提示著GSDME很可能對腫瘤細胞中的孔形成發揮替代作用。人們目前正在研究GSDME表達克服高甲基化調控的方式以及GSDME是否具有除孔形成以外的常規功能目前正在處于研究當中。

　　這項研究的重要發現是CAR-T細胞比未轉導的天然T細胞釋放更多的穿孔素/粒酶B。T細胞釋放溶細胞性效應分子取決于兩種信號的激活：MHC-抗原肽-TCR（信號1）和CD80/CD86-CD28（信號2）。信號2的完全激活取決于TCR信號的激活強度。TCR信號激活的輕鏈激酶（LCK）使得CD28酪氨酸殘基發生磷酸化；與此同時，TCR信號激活的LAT和SLP-76磷酸化和激活關鍵的CD28下游信號分子PLC-γ，因而將磷脂酰肌醇4,5-雙磷酸（PIP2）降解為二酰甘油（DAG）和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。

　　基于對T細胞激活的了解和基因工程取得的進步，這些研究人員設計出針對人類T細胞的合成CAR。設計CAR的基本概念是將單鏈可變區片段（scFv）與CD3ζ細胞內信號轉導模塊連接在一起，以在抗原結合后誘導T細胞激活。當前，這種模塊化結構已從單個CD3ζ信號結構域擴展到CD3ζ-CD28、CD3ζ–4-1BB或CD3ζ–CD28–4-1BB信號結構域，以模擬信號1和信號2。

　　鑒于CAR與其抗原之間的親和力可能比TCR與MHC-肽復合物之間的親和力高100倍，因此這種優越的親和力加上共刺激信號使得CAR-T細胞能夠釋放大量的穿孔素/粒酶B，這是CAR-T細胞介導的靶細胞經歷細胞焦亡所必需的。一旦進入細胞質后，顆粒酶B可以將caspase 3的無活性前體（procaspase 3）裂解為它的活性形式。活化的caspase 3誘導細胞凋亡或裂解GSDME，這種理解通過膜孔形成觸發細胞焦亡。但是，細胞具有快速修復質膜中形成的孔的能力。GSDME是否觸發細胞焦亡取決于膜孔形成與膜修復之間的平衡。盡管具有相同的GSDME數量，但是天然的TCR CD8+ T 細胞僅導致低水平的GSDME裂解，而CAR-T細胞釋放出更高水平的穿孔素/粒酶B，因而導致更多的GSDME激活。

　　由于釋放富含損傷相關分子模式（DAMP）分子的細胞質內容物，細胞焦亡中發生的裂解具有高度促炎性。在這項研究中，這些研究人員證實腫瘤細胞經歷的細胞焦亡導致巨噬細胞中的caspase 1和GSDMD的激活，從而導致大量促炎細胞因子的釋放和CRS的發生。在這些促炎細胞因子中，IL-6和IL-1β尤為重要。臨床上，中和IL-6的抗體被廣泛用于預防和/或治療接受CAR-T細胞治療的患者中發生的CRS。作為多效細胞因子，IL-6主要受到NF-κB、AP-1和STAT3等轉錄因子的調節。諸如脂多糖（LPS）之類的病原體相關分子模式（PAMP）分子和諸如熱休克蛋白（HSP）和HMGB1之類的DAMP分子可通過激活這些轉錄因子來刺激巨噬細胞產生IL-6。

　　這些研究人員發現HMGB1存在于細胞焦亡的上清液中，因而直接激活巨噬細胞中的IL-6。 IL-1β是以前體形式合成的，它的釋放取決于caspase 1的激活，caspase 1是一種受到炎性體嚴格調節的促炎性半胱天冬酶。炎性體NLRP3已被包括微生物毒素、顆粒物、晶體、β-淀粉樣蛋白聚集物或細胞外ATP在內的多種刺激物廣泛激活。

　　在這項研究中，這些研究人員發現細胞焦亡的上清液含有ATP，用P2X7受體拮抗劑處理或降解ATP可抑制細胞焦亡的上清液激活巨噬細胞中caspase 1的能力。在他們開發的小鼠CRS模型的幫助下，他們進一步證實不論是敲除靶腫瘤細胞中的GSDME，也不論是剔除巨噬細胞，還是抑制caspase 1/GSDMD都可阻止CRS的發生。闡明這種分子途徑對于更好地了解與CAR-T細胞療法相關的毒性至關重要。2018年，Verena Staedtke等人已發現兒茶酚胺阻斷劑可以抑制巨噬細胞釋放促炎性細胞因子。因此，對GSDME和兒茶酚胺的聯合阻斷可以在不降低腫瘤清除的情況下更好地治療CRS。

　　盡管這項研究報道CAR-T細胞通過GSDME依賴性途徑誘導靶腫瘤細胞遭受細胞焦亡，但也可能存在其他途徑來介導CAR-T細胞引起的靶細胞焦亡。近期研究已報道CAR-T細胞可能動員TNF-α來介導這種殺傷過程，不過這可能與顆粒酶B和穿孔素無關。這項發現的一種可能性是CAR-T細胞可以使用一種兩步驟策略來攻擊靶細胞。顆粒酶B和穿孔素引發了第一波殺傷，如果靶細胞逃脫了第一波攻擊，那么TNF-α就會發起第二波殺傷。這也可能解釋了為何細胞焦亡可在不顯著影響CAR-T細胞介導的殺傷作用的情況下不被阻斷。當前的這項研究揭示了CAR-T細胞和天然的TCR-T細胞導致的細胞死亡類型之間存在機制上的差異，這就為通過將腫瘤細胞死亡從細胞焦亡切換到細胞凋亡來修飾CAR以減少CRS提供了機會。

　　參考資料：

　　Yuying Liu et al. Gasdermin E–mediated target cell pyroptosis by CAR T cells triggers cytokine release syndrome. Science Immunology, 2020, doi:10.1126/sciimmunol.aax7969.