手性色譜柱知識（二）

環糊精型：

環糊精是通過Bacillus Macerans 淀粉酶或環糊精糖基轉移酶水解淀粉得到的環型低聚糖。通過控制環糊精轉移酶的水解反應條件可得到不同尺寸的環糊精。市售的環糊精主要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環糊精分子成錐筒型，構成一個洞穴，洞穴的孔徑由構成環糊精的吡喃葡萄糖的數目決定。環糊精類型及洞穴的孔徑等見下表：

環糊精 糖元數目 洞穴孔徑 可進入洞穴的分子類型 手性中心數目

α 6 4.5-6.0 5-6元環的芳香族化合物 30

β 7 6.0-8.0 聯苯或萘 35

γ 8 8.0-10.0 取代芘和類固醇 40

2，3位仲羥基分布在環糊精洞口，6位伯羥基在環糊精分子的外部，這意味著洞穴內部是相對疏水的區域。用環糊精手性固定相產生手性識別要求被拆分物的疏水部分能嵌入環糊精洞穴中，形成可逆的、穩定性不同的包合物，環糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團相互作用。

由于形成包合物速度較慢，因此可能導致色譜峰峰形較差，同樣也影響了其在制備色譜中的應用。環糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小；α-環糊精只能允許單苯基或萘基進入，β-環糊精允許萘基及多取代的苯基進入，γ-環糊精僅用于大分子萜類。β-環糊精手性固定相應用范圍最廣。Ibuprofen通過β-環糊精色譜柱得到分離，說明了pH值對氫鍵的影響。當流動相的pH=7時，觀察不到拆分的跡象。pH=4時，可達到好的分離效果。通常分離氨基酸時，常采用低的pH值，以抑制酸性基團的離子化，同時也增強氨基的質子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對β-環糊精色譜柱來說是很好的緩沖液。通常緩沖液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調節到合適的pH值。高的流速會降低形成復合物的能力，低流速分離效果較好，0.5-1ml/min的流速最好。另外，增加緩沖液的濃度可以克服流速的影響，因為它可以增加環糊精洞穴和流動相的吸引力。

常用緩沖液及其使用濃度如下表所示：

緩沖液 濃度 目的

TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2%

NH4NO3 10-500mM (用于減小包埋)

檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合于酸性化合物)

醋酸銨 10-200mM

pH值選擇見下表:

醇和胺 pH4(加強NH的離子化)

酸 pH7

優化手性分離條件要考慮的方面有：pH值對分離度的影響；流速對分離度的影響；柱溫、有機相比例、緩沖鹽濃度對分離度的影響。

環糊精的修飾：最近，對環糊精的修飾使環糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，并可用于氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環狀對甲苯酰酯。這些新型的環糊精固定相有許多優點，它們可以分離更多化合物，價格上也有競爭力，由于改進了手性識別能力使其更適用于制備色譜。

配位交換型：

手性配位交換色譜（Chiral Ligand Exchange Chromatography，CLEC）由Davankov發明，是通過形成光學活性的金屬絡合物而達到手性分離，屬于Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，主要用于分離氨基酸類。

由于此類固定相是由手性氨基酸—銅離子絡合物鍵合到硅膠或聚合物上形成，因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用于手性配位交換色譜，但銅離子應用最廣。形成絡合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，最佳溫度約50℃。

手性配位交換色譜僅對α- 氨基酸和其類似物有效。β- 氨基酸很難用手性配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用于制備，由于流動相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。

大環抗生素型：

大環抗生素型手性色譜柱是最近發展起來的，通過將大環抗生素鍵合到硅膠上制成的新型手性色譜柱。大環抗生素型手性色譜柱的出現歸功于Dan Armstrong的貢獻。此類色譜柱常用的大環抗生素主要由三種：利福霉素（Rifamycin），萬古霉素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福霉素作為手性添加劑在毛細管電泳分離手性化合物方面得到了成功運用。萬古霉素和替考拉寧分子結構中存在“杯”狀結構區和糖“平面” 結構區。此類色譜柱性質穩定，可用于多種分離模式。手性分離基于氫鍵、π-π作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。

替考拉寧分子量為1885，結構中存在20個手性中心，3個糖基和4個環。酸性基團在多肽“杯”/ “裂層”的一端，堿性基團在它的另一端。酸性基團和堿性基團提供了離子作用點。糖基在三個平面上，可折疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。

萬古霉素分子量為1449，結構中存在18個手性中心，3個環。萬古霉素具有“籃狀”結構，它的附近還有一個可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊緣，參與和分析物分子產生離子作用。萬古霉素手性色譜柱可用于反相模式、正相模式和極性模式。萬古霉素手性色譜柱可以分離胺類、中性酰胺、脂類。但對于酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩沖液。色譜柱適用的pH范圍為4-7。通常優化堿性化合物手性分離條件時，選擇pH=7 為起點比較好。另外四氫呋喃、乙腈有最好的選擇性。有時采用純的甲醇和乙醇作流動相也可達到好的分離效果。萬古霉素手性色譜柱也可用正相模式，采用正己烷/乙醇為流動相。
萬古霉素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用于制備色譜。

蛋白質型：

蛋白質型手性色譜柱屬于第5種類型。分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用。已經有多種蛋白質用于此類手性色譜柱。目前使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。
α-酸性糖蛋白分子由181個氨基酸殘基和40個唾液酸（sialic acid） 殘基構成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點為2.7。含有兩個二硫鍵，性質很穩定。α-酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到硅膠上，制成手性色譜柱，可以分離許多化合物。

α-酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動相通常為pH 4-7的磷酸鹽緩沖液和很小比例的有機相。有機相首選異丙醇，如達不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機相的改變導致蛋白結構發生暫時的改變。色譜柱的負載量至關重要，典型的負載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進樣20μl。pH 的改變對手性選擇性起關鍵作用，尤其是胺類化合物。pH降低導致蛋白質負電荷的降低，引起胺類化合物保留時間減小，然而這意味著可以減小有機相比例，使選擇性增加，峰形改善。

通過調節有機相比例仍無法達到分離效果時，有時需用電荷調節劑。但這可能引起蛋白結構的永久改變，這些電荷調節劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時間，減小分離因子。

人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點為4.8。蛋白中認為存在兩個藥物結合位點：華法令-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone） 和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結合位點。流動相中加入辛酸，采用人血清白蛋白手性色譜柱可以有效分離benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分離，流動相組成為：100mM磷酸緩沖液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。

牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點為4.7。此蛋白為一個單氨基酸鏈，通過17個二硫鍵形成9個雙環。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分離。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白穩定，一些有機溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此使用起來要特別注意。

卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分離大量的胺類和酸類化合物。

蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在制備色譜中的應用。

蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是應用最廣的色譜柱，但并不是效果最好的色譜柱。

冠醚型：

冠醚類固定相用于分離一級胺，一級胺必須質子化方能達到分離。因此必須使用酸性流動相，如高氯酸。最常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化產品，由Daicel公司制造。無論（+）或（-）型均可達到有效分離，并可通過變化（+）（-）類型而改變分析物出峰順序。冠醚作為添加劑也用于核磁共振和電泳，但由于其毒性較大，有致癌性，使其應用受到限制。