抗原呈遞細胞的選擇和制備（二）

備 選 方 案 2 Con A 刺激的腹腔巨噬細胞的制備

此方案中不使用致病菌，但巨噬細胞獲得率較低。將 Con A 溶 解 于 PBS (200ul/ml) ，用 0.22/xm 的濾器過濾，然后保存于 一 20°C 。 每只小鼠腹腔注射 500ul (IOOug)C o n A (附錄 2E ) ， 4d 后收集腹腔巨噬細胞（見基本方案，步 驟 3? 9) 。

備 選 方 案 3 骨髓來源的巨噬細胞的制備

附 加 材 料

10% ( V A O L929 細胞條件培養基（見輔助方案 2)，溶解于 D M E M -10 完全培養基

0.05% (V /V ) 胰蛋白酶/0.53m m o l / L E D T A

100U/ml (lOng/ml) 重組小鼠 IFN- 7 , 溶 解 于 l 〇 % L 929 條件培養基

5m l 注射器和 25 G 針頭

I O O m m 無菌培養皿

IOml 無菌吸管

70p m 無菌尼龍濾網

細胞培養皿和培養瓶（可選用）

9 6 孔平底培養板或 2 4 孔培養板或 I O O m m 細胞培養皿

1 . 處 死 小 鼠（附 錄 2 G )，取出股骨并去除肌肉（單 元 6.1)。

2.剪斷股骨，通 過 5m l 注 射 器 和 25 G 針 頭 用 4 ml 1 0 % L 929 條件培養基沖洗出骨髓，將骨髓收集至無菌 I O O m m 細胞培養皿。

3 . 用 IOml 無菌吸管反復吹打細胞團塊，將細胞懸液通過 70 Mm 無菌尼龍濾網。

4.取部分細胞懸液以 1 : 5 懸 浮 于 3 % 乙酸，以溶解紅細胞。加 入 等 量 的 0 . 4 % 臺盼藍染液計數活細胞。據此 用 1 0 % L 929 條件培養基調節細胞濃度至 IO6 個細胞/ m l 。

5a 擴增細胞：將細胞置于培養皿或培養瓶中培養 7d ，用 0.05% (V A O 胰蛋白酶/0.53 mmol/L E D T A 消化，收集細胞并以 5 X IO⁴?IO⁵ 個細胞/孔 置 于 9 6 孔培養板
中培養。

5b. 不擴增培養：將細胞置于培養板：

9 6 孔培養板： 0.2m l 細胞懸液/孔

2 4 孔培養板： I m l 細胞懸液/孔

I O O m m 培養皿： 12m l 細胞懸液/個

6.對于擴增的細胞，繼續培養 1?2d 直至細胞匯合。對于未擴增培養的細胞需培養 5?7d ，用 1 0 % L 929 條件培養基每 2 天換液。

7 . 為了增強抗原呈遞效率，可在抗原呈遞實驗前 4 8 h 用 l O O U / m l 溶 解 于 1 0 % L 929 條件培養基的重組小鼠 IFN-y ( l O n g / m l ) 處理細胞。

輔 助 方 案 2 制 備 L9 2 9 條件培養基

材 料

貼壁培養 L 929 細 胞（A T C C 細胞株號 C C L l )

V 無 菌 P B S ，室溫

0 . 0 5 % (W V ) 胰蛋白酶/O.53 mmol/L EDTA

V D M E M -IO 完全培養基

15m l 離心管

Sorvall RT- 6 0 0 0 冷凍臺式離心機及 HB-IOOO 轉子

培養瓶

0.45um 濾膜

1.在 25 cm2 培 養 瓶 中 培 養 L 9 2 9 細 胞 ，當細胞處于對數生長期并匯合生長時吸棄上清(10 ml)。加 入 3m l 室 溫 無 菌 P B S ，搖 動 培 養 瓶 后 靜 置 lmin，輕輕搖動一次后吸棄 P B S 。

2.加入 3m l0 . 0 5 % (V /V ) 胰蛋白酶/0.53 mm 〇 l/L E D T A 靜 置 5 min。 蓋緊瓶蓋，拍打培養瓶使細胞脫落，也可在顯微鏡下觀察細胞脫落情況

3 . 加 入 IQml D M E M -I O 完 全 培 養 基 并 將 細 胞 懸 液 轉 移 至 15m l 離 心 管 ， 4°C ， 400?500 g 離 心 lOmin，吸棄上清后，將細胞懸浮于和原培養基等量的 D M E M -10 完全培養基中。

4 . 將細胞懸液用 D M E M -I O 完全培養基作 1 : 1 0 (W V ) 稀釋并轉移至適當大小的培養 瓶 中（0.4m l 細胞懸液/c m 2 培養瓶）。繼 續 37°C 培養直至細胞匯合，一般需要一周 。

5 . 收集細胞上清，用 0.45p m 濾膜過濾并分裝成每份 1?15m l ，置一 20°C 凍存。

備 選 方 案 4 制 備 LPS 刺 激 的 B 細胞

材 料

懸 浮 于 D M E M -I O 完全培養基中的脾臟細胞懸液（單 元 2. 1)

x/ D M E M -10 完全培養基， 37°C

LPS (如 Difco 或 Sigma)

I O O m m 細胞培養皿

50m l 無菌離心管

Sorvall R T - 6 0 0 0 冷凍臺式離心機及 H B - I O O O 轉子

75 cm2 細胞培養瓶

1 . 用 A C K 紅 細 胞 裂 解 液（單 元 2 . 1 ) 去除脾細胞懸液中的紅細胞。

2 . 將細胞懸浮于 D M E M -I O 完全培養基，計 數 活 細 胞（附 錄 3 0 , 調節細胞濃度至 5 XIO⁶個細胞/ml。

3 . 將細胞轉移至 I O O m m 細 胞 培 養 皿（IOml/培養皿）中，并 在 37°C 培 養 2 h ，輕輕搖動培養瓶后，將懸浮細胞轉移至 50m l 離心管。

4 . 室溫， 200?300 g 離 心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于預熱的 D M E M -I O 完全培養基，計 數 細 胞（附 錄 3 0 , 調節細胞濃度至 2 X 10⁶ 個細胞/m l 。

5 . 加 入 L P S 至終濃度 10 Mg/m l 。將細胞懸液轉移至 75 cm2 細胞培養瓶或 I O O m m 細胞培養皿 ， 37°C 培 養 48 h 。

6 . 輕輕搖動培養瓶使非貼壁細胞懸浮，將細胞懸液轉移至 50m l 離心管， 200?300 g 離心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于 D M E M -1 0 完全培養基。

7.200?300 g 離 心 lOmin，吸棄上清，將細胞再次懸浮于預熱的 D M E M -1 0 完全培養基 ，計數細胞，調節細胞濃度至 2 X 10⁶個細胞/m l 。這些細胞就可用作非貼壁的抗原 呈 遞 細 胞（單 元 7. 2)。