放射性標記的探針與固定在膜上的核酸的Southern雜交

固定于膜上的 DNA 無菌水配的 poly (A) RNA DNA 或 RNA 探針 鮭魚精 DNA

磷酸-SDS 洗液 預雜交 雜交液 水相緩沖液雜交用溶液 甲酰胺緩沖液雜交用溶液

放射性墨水標記的不干膠標簽或者磷光不干膠標簽 雜交瓶 預先調到適宜溫度的孵箱或商業獲得的雜交裝置 孵箱或水浴振蕩器 沸水浴

一、材料

1. 緩沖液及溶液

磷酸-SDS 洗液 1（40 mmol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，5% (m/V) SDS，0.5 (m/V)牛血清白蛋白成分 V）

磷酸-SDS 洗液 2（40 mmol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，5% (m/V) SDS）

預雜交/雜交液

水相緩沖液雜交用溶液（6X SSC ( 或 6X SSPE)，5X Denbardts 試劑，0.5%（m/V) SDS，1 μg/ml poly (A)，100 μg/ml 鮭魚精 DNA，50%（V/V）甲酰胺）

甲酰胺緩沖液雜交用溶液（0.5 mol/L Na₃PO₄ （pH 7.2)，1 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，7% (m/V) SDS，1% (m/V) 牛血清白蛋白）

Na₃PO₄ （1 mol/L，pH 7.2)

2. 核酸及寡聚核酸

固定于膜上的 DNA

無菌水配的 poly (A) RNA (10 mg/ml)

DNA 或 RNA 探針

鮭魚精 DNA ( 約 10 mg/ml)

3. 專用設備

放射性墨水標記的不干膠標簽或者磷光不干膠標簽

雜交瓶

預先調到適宜溫度的孵箱或商業獲得的雜交裝置

預先調到 65℃ 的孵箱或水浴振蕩器（應用于磷酸-SDS 緩沖液中的雜交）

沸水浴

二、方法

1. 將含有靶 DNA 的膜漂浮在盛有 6X SSC ( 或 6X SSPE) 的皿中直到膜自下而上完全浸濕。將膜浸于溶液中 2 min。

2. 用下列方法之一進行預雜交

(1) 在熱密封的袋中進行的雜交

① 將膜塞入熱密封袋中（如 Sears Seal-A-Meal 或相應設備)，按每平方厘米 0.2 ml 加入預雜交液中。盡量將袋中的空氣擠出。

② 用熱封口機密封袋的開口端兩次。輕輕擠壓袋子以檢查密封的強度及是否完整。 將袋子放在適宜溫度的水浴中（水性溶劑雜交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42℃；磷酸-SDS 雜交液 65℃）。

(2) 雜交瓶中進行的雜交

① 輕輕的將濕潤的膜卷成圓柱狀與制造商提供的塑料網一起放入雜交瓶。按每平方厘米膜 0.1 ml 加入預雜交液。將瓶蓋擰緊。

② 將雜交管放入預先加熱到適宜溫度的雜交爐中（水性溶劑雜交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42℃；磷酸-SDS 雜交液 65℃)。

(3) 塑料容器中進行的雜交

① 將濕潤的膜放在塑料（如 Tupperware) 容器中，按每平方厘米膜 0.2 ml 加入預雜交液。

② 用蓋子密封盒子，將盒子放入預設到適宜溫度的空氣孵箱中的振蕩平臺上（水性溶劑雜交液 68℃；含有 50% 的甲酰胺的雜交液 42℃；磷酸-SDS 雜交液 65℃ )。

3. 如果放射性標記的探針是雙鏈 DNA，100℃ 加熱 5 min 變性，迅速將探針放入冰水浴中冷卻。

4. 若要使探針與包含基因組 DNA 的膜雜交，請按照下列方法之一進行

(1) 在熱密封的袋中進行的雜交

① 迅速將裝有膜的塑料袋從水浴中取出。用剪刀剪開一角打開袋子，將預雜交液倒出。

② 將交性的探針加到適量的新鮮預雜交液中，并將溶液轉入袋子。盡量將袋中的空氣擠出。

③ 用熱封口機重新密封袋子；使袋中盡可能少地殘留氣泡。為了避免水浴的放射性污染，將重新封口的袋子密封于另一個未污染的袋子中。將袋子浸入適宜所需雜交階段溫度的水浴中。

(2) 在雜交瓶中進行的雜交

① 將預雜交液從雜交瓶中倒出并加入新鮮的含有探針的雜交液。

② 封好瓶口重新放入雜交爐。放盤在適宜的溫度下。

(3) 在塑料容器中進行的雜交

① 將膜從容器中轉移到密封的袋子或雜交瓶中。

② 迅速按照上述方法處理。

5. 雜交后，洗膜。

(1) 在熱密封袋中進行的雜交

① 帶上手套，將袋子從水浴中取出，去掉外層的袋子，迅速地將內層袋子剪去一角。 將雜交液倒入處理放射性污染的廢液缸中，然后沿三邊將袋子剪開。

② 將膜取出迅速浸入含有數百毫升 2X SSC 及 0.5% SDS 的皿中（即每平方厘米膜約 1 毫升），室溫下將平皿放在緩慢的旋轉平臺上輕輕振蕩。

(2) 在雜交瓶中進行的雜交

① 將膜從雜交瓶中取出，夾住露出瓶口的膜的一角將多余的雜交液晾干。

② 將膜沒入含有數百毫升 2X SSC 及 0.5% SDS 的皿中（即每平方厘米膜約 1 毫升室溫下將平皿放在緩慢的旋轉平臺上輕輕振蕩。

6. 5 min 后，將第一遍洗液倒入處理放射性污染的廢液缸中，在皿中加入數百毫升 2X SSC 及 0.1 % SDS。室溫下放置 15 min 并輕輕振蕩數次。

如果雜交是在磷酸-SDS 緩沖液中進行的，將膜浸入 65℃ 的磷酸-SDS 洗液 2 中共 8 次，每次 5 min。然后直接進行步驟 9。

7. 將浸泡的溶液換成數百毫升新鮮的含有 0.1% SDS 的  0.1X SSC。65℃ 下放置 30 min~4 h，并輕輕振蕩。

8. 室溫下用 0.1X SSC 洗膜。

9. 將膜放在一疊紙巾上以去除大部分液體。將潮濕的膜放在一張 Saran 包裝膜上。在 Saran 包裝膜上取幾個不對稱的位置貼上用放射活性墨水（或磷光點）標記的黏性點標簽。這些標記物可以與膜一起進行放射自顯影。用 Scotch 膜覆蓋標簽。這樣可以避免污染顯影夾或使放射性墨水污染增感屏。

也可以將膜在空氣中干燥后用水溶性膠水黏在一張 3 MM 濾紙上。

10. 用 Saran 包裝膜覆蓋膜，放在增感屏內 -70℃ 用 X 線片曝光 16~24 h 以獲得放射自顯影的圖像。