文獻研究：質譜流式（CyTOF）的高端應用

質譜流式細胞術是指用穩定的重金屬同位素（主要是鑭系元素）代替熒光基團來標記抗體。然后將細胞引入CyTOF分析儀并霧化成液滴，液滴被汽化、霧化、電離，然后通過電勢加速被帶入質譜儀。最后，用TOF探測器對過濾后的離子云進行分析。

圖1.質譜流式工作原理

盡管質譜流式細胞術通常被認為是一種基于熒光流式細胞術的改變，但質譜流式細胞術與熒光細胞術在幾個方面有所不同，包括檢測參數、靈敏度等。（見表1）

CyTOF方法的不斷改進為實施各種功能分析以解決細胞免疫學的復雜性提供了新的機會。在這里，我們對基于CyTOF的功能分析做了如下概述（如圖2）

圖2.使用CyTOF進行功能分析的示意圖。

目前功能分析的創新可分為12類：(A)表型特征分析；(B)細胞內細胞因子測定；(C)細胞內信號狀態表征；(D)細胞體積和大小測量；(E)細胞活力鑒別；(F)細胞周期識別；(G)增殖追蹤；(H)受體占用率測定；(I)基于四聚體的抗原特異性T細胞篩選；(J)染色質修飾分析；(K)RNA和蛋白共檢測；(L)成像質譜流式細胞術。

由此不難發現，CyTOF在免疫學領域的益處是顯而易見的。結合新的生物信息學技術，CyTOF在癌癥、免疫治療、自身免疫性疾病、傳染性疾病、心血管疾病和神經科學等多個領域的研究有著廣泛的應用前景，并且已有多篇高分文獻出爐。

接下來，小編將通過兩篇高分文獻為大家詳細介紹質譜流式在單細胞代謝及covid-19發病機制研究中的應用。

一、美國斯坦福大學醫學院Sean C. Bendall課題組揭示了人的毒T細胞單細胞代謝譜（IF：54.9）

細胞代謝調節免疫細胞的激活、分化和效應功能。目前細胞代謝方法主要是基于對選定的代謝途徑的代謝物和中間產物的定量，通過質譜批量分析代謝物的豐富，或者通過一種被稱為細胞外通量分析的方法，分別測量氧消耗和細胞外環境的酸化，來表征OXPHOS和糖酵解活性的情況。但目前的代謝方法缺乏單細胞分離和同時進行的細胞表型表征。

在本研究中，研究者開發了一種表征單細胞代謝調節規律及其表型特征的方法，即單細胞代謝調節圖譜（scMEP）（如圖1.1）。該方法使用基于抗體的高維方法量化調節代謝途徑活性的蛋白質。

圖1.1.scMEP方法概述。

研究者獲得了全血細胞，并通過表型標記物鑒定了主要的免疫細胞譜系，因此，能夠進行硅子集篩選和比較細胞譜系的代謝調節，而不需要預先分離或富集。研究者觀察到與先前確定的功能作用一致的譜系特異性代謝狀態。另外發現代謝特征在很大程度上能夠分離免疫細胞譜系并預測大部分細胞的免疫細胞身份（如圖1.2）。表明了scMEP在研究代謝調節及其與單細胞特化的關系方面的適宜性和穩健性，并揭示了人類免疫系統中顯著的細胞類型特異性代謝多樣化。

1.2.單細胞代謝調節譜組織人類免疫系統。

為了建立基于抗體的單細胞代謝特征與通路活性之間的關系，研究者激活了人幼稚和記憶T細胞(包括CD4+和CD8+)，并通過質譜流式細胞術和細胞外流量分析對其進行了分析。發現在通路激活時代謝活性升高。對每個細胞獨立計算的scMEP評分顯示，在單細胞水平上，糖酵解和氧化機制同時上調。（如圖1.3）

這些數據驗證了基于scMEP的細胞代謝調節物的定量與通過一種成熟的正交方法評估的通路活性之間的密切關系，并證明了scMEP能夠在單細胞水平上發現代謝異質性。

圖1.3.T細胞活化動力學的單細胞代謝調節組譜

為了研究人T細胞的代謝重塑及其與細胞活化、分化和增殖的關系，研究者利用大規模細胞計數法(CyTOF)對scMEP在大量代謝測定時進行基準測試，觀察到信號分子(如核糖體蛋白S6)的早期磷酸化和轉錄因子(如缺氧誘導因子HIF1A)的誘導，隨后是代謝酶的上調(GLUT1，HK2和LDHA)，表明活化的初始T細胞中代謝重塑的開始。

利用代謝特征表達隨偽時間的變化，研究者定義了人類初始CD8+T細胞代謝重塑過程中的三個拐點。（如圖1.4）

圖1.4.代謝重組的整合模型揭示了人類T細胞激活的決定因素

除了細胞固有因素外，代謝狀態還受其所在組織的影響，強調了在體外和臨床樣本中直接確定代謝狀態的重要性。研究者將該方法應用于臨床樣本，研究人員在人直腸癌中鑒定了組織特異性、代謝抑制的細胞毒性T細胞（如圖1.5）。

圖1.5.細胞毒性T細胞的代謝狀態反映了其駐留組織

將該方法與飛行時間多重離子束成像相結合（MIBI-TOF），研究人員揭示了人體組織中代謝基序的空間組織，并表明代謝抑制的免疫細胞被排除在腫瘤免疫之外。（圖1.6.）

圖1.6基于成像的scMEP分析揭示了空間對代謝特征組織的影響。

總之，研究者在此提出了一種使用基于抗體的多重技術研究單細胞代謝的穩健方法。scMEP的應用應有助于更好地了解人類免疫細胞生物學，并有助于識別疾病相關的代謝改變，這些改變可作為多種人類疾病的潛在生物標志物和治療靶點。

二、美國斯坦福大學醫學院Bali Pulendran課題組揭示了covid-19的發病機制和潛在的治療靶點（IF：47.7）

新冠病毒在全球迅速傳播，分離、測序和克隆病毒的研究進展也很迅速，包括開發診斷試劑盒并測試候選疫苗等。然而，關于人類免疫系統與SARS-CoV-2病毒之間動態相互作用還不清楚。

本研究中作者使用質譜流式技術、單細胞轉錄組學、以及多因子檢測技術等分析了來自兩個地區的76名 COVID-19 患者和年齡性別匹配的69名對照組的免疫反應。結果表明，SARS-CoV-2感染會導致T細胞衰竭和凋亡及外周I型IFN反應受損，血漿細胞因子數據可用于區分嚴重和中度COVID-19病征。另外，嚴重的COVID-19感染與細菌產物的全身釋放有關，EN-RAGE、TNFSF14、OSM 和 IL-6等分子及其受體可能是有吸引力的治療靶點。

圖2.1 COVID-19患者外周血白細胞的質譜流式分析。

為了確定PBMCs中的免疫細胞分型，作者使用質譜流式技術分析了22個細胞表面標志物和12個細胞內標志物，以及針對各種激酶和信號分子的磷酸化特異性表位和組蛋白修飾標志物H3K27ac。

磷酸化-CyTOF鑒定了12種主要的先天性和適應性免疫細胞亞型，兩個隊列中所有感染個體的漿母細胞和效應CD8 T細胞的頻率顯著增加(圖2.1B)，且PBMC中pDC的頻率顯著降低(圖2.1C)，pDC反應的動力學與癥狀出現的時間及臨床嚴重程度無關。另外，pS6（mTOR激活的典型靶標）的表達降低，pDCs和mDCs中的IKBα降低(圖2.1D和E)。mTOR信號傳導可介導pDC中IFN-α的產生，表明pDC在COVID-19患者中產生IFN-α的能力可能受損。

圖2.2 COVID-19 患者的外周血白細胞體外刺激后的流式細胞術分析。

細胞內染色測定結果顯示，與健康對照相比，患者經TLR刺激后pDC中的IFN-α減少(圖2.2A)，且TNF-α反應也顯著降低，這表明pDC在COVID-19感染中功能受損。而對細菌配體混合物（由TLR2、TLR4和TLR5配體組成）或病毒TLR混合物的刺激，mDCs和單核細胞的反應也顯著降低(圖2.2B)。此外，降低的IKBα水平并未轉化為增強的NF-κβ亞基p65磷酸化(圖2.2C)。結果表明，無論臨床嚴重程度如何，COVID-19患者周圍的先天免疫細胞對TLR刺激的反應都會受到抑制。

圖2.3 COVID-19 患者血漿中細胞因子檢測分析。

多因子檢測分析來自亞特蘭大隊列的血漿樣本發現有43種細胞因子包括IL-6、MCP-3和CXCL10在COVID-19患者中顯著上調(圖2.3上)。雖然血液骨髓細胞和pDC中的細胞因子反應受損，但炎癥分子的血漿水平顯著上調，表明血漿中細胞因子的組織來源是有爭議的。

另外多因子和ELISA均證實TNFSF14、EN-RAGE和OSM在COVID-19患者中也是顯著增強并與臨床嚴重程度密切相關(圖2.3下)。結果表明，COVID-19感染會誘發一種獨特的炎癥程序，其特征可能是從肺部釋放細胞因子，但會抑制外周的先天免疫系統。

圖2.4 COVID-19 感染早期ISG的短暫表達。

單細胞大規模多維分析工具CITE-seq數據顯示COVID-19患者中的幾個簇包括漿母細胞、血小板、紅細胞以及粒細胞群(圖2.4B)。DEG的過度代表性分析表明許多ISG在單核細胞和樹突細胞中上調(圖2.4C)，除了在T和NK細胞中適度水平的IFN-γ表達外，無法檢測到任何IFN-α和-β基因的表達(圖2.4D)， 高靈敏度ELISA驗證血漿中IFN-α的濃度發現，感染后逐漸升高至第8天左右達到峰值，并在第20天回落至基線水平(圖2.4E)。

CITE-seq和RNA-seq數據都表明患者ISG水平升高，但也受臨床嚴重程度的影響(圖2.4)。在SARS-CoV-2感染早期，可在外周誘導ISG的循環IFN-α水平較低，因此外周的先天免疫細胞產生炎癥細胞因子的能力受損。

通過質譜流式技術對單細胞表面的蛋白標志物更高分辨率的定量檢測，結合其他單細胞相關技術，可以更快速精準的獲得新發現。更詳細的文章內容可通過下載文末所附的參考文獻查看哦~

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為了進行更有效的抗體標記，質譜流式實驗需要抗體緩沖液中不含有任何載體，即不含甘油、疊氮化鈉等成分。但兩篇文獻中選用的抗體大多含有甘油成分，如選用此類抗體，可通過甘油去除方案（聯系優寧維索取）進行去除。

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