近年來，隨著活細胞體系單分子熒光成像技術的發展，膜蛋白單分子研究，特別是受體動力學的研究，已成為目前單分子研究領域中最活躍的研究方向之一。近幾年發展起來的超分辨成像技術因其能夠突破光學衍射極限，而比傳統光學顯微鏡具有更高的分辨率和更高的定位精度。
英國Oxford
Nanoimaging公司最新推出的超分辨熒光顯微鏡—Nanoimager，由牛津大學Achillefs
Kapanidis教授團隊經過8年時間研發而成，是全球第一臺大視野單分子FRET顯微鏡，將以超強的分辨率在單分子示蹤、活細胞成像、蛋白互作、3D成像等研究領域發揮重要作用。
Nanoimager主要技術特點
? 橫向分辨率<20nm；縱向分辨率<50nm
? 穩 定 性：<1 μm/K的漂移；<1 nm (1 Hz to 500 Hz)振幅
? 支持同時雙色成像和順序四色成像
? 采用1級激光，使用安全
圖1 Nanoimager 超分辨成像
Nanoimager采用PALM/dSTORM技術和光激活定位顯微技術 (PALM) ，利用單分子定位算法并結合光學系統艾里斑的形狀，以超高精度（納米量級）獲得熒光分子的中心位置，然后用CCD將其信號進行采集轉化最終得到分辨率為20nm的超分辨圖像。
Nanoimager主要應用案例
1、單分子FRET
FRET是一種兩個熒光分子間非輻射性的能量轉移方式，反映兩者的分子間距（一般在2 – 10 nm的間距發生）。Nanoimager是世界第一臺用于大視野單分子熒光共振能量轉移(smFRET)的商業化儀器，其適用于smFRET的關鍵功能包括：同時雙色成像；單分子散射光強度和總體平均的實時分析；視野中數千個單分子的高通量成像，以及用交替熒光激發 (ALEX) smFRET的功能來定量化學計量與FRET效率。圖2是smFRET用于研究單個DNA霍利迪交叉的動力學。
圖2 用smFRET檢測霍利迪交叉(HJs)的實時構象變化
2、單分子示蹤
Nanoimager可以在兩個通道同時示蹤細胞或者純化物樣品中的單分子 (圖3)，并計算擴散系數。細胞中分子的擴散系數可以被示蹤，如酶或蛋白可以通過藥物和抗生素的反應來示蹤。低擴散率可以表示標記分子與另一分子或結構的相互作用或相結合。
Nanoimager可以直接反映純化樣品中熒光粒子的擴散率和預估大小，具有敏感性 (單熒光分子級別) 和特異性 (雙色標記可以顯著降低檢測雜質的可能性)。
圖3 Nanoimager雙色追蹤單分子/粒子
3、更大視野的成像
Nanoimager的每個成像通道均有50 μm x 80 μm的大視野，且照明均勻，可以實現單分子或細胞的高通量成像并快速收集數據。圖4顯示了以10倍于其他技術的速度對突變的大腸桿菌細胞的不同表型進行成像。為了獲得不同表型的可靠的結果，需要對大量細胞進行比較。使用具有大視野，能夠自動對焦和自動獲取數據的Nanoimager可以顯著加快整個實驗速度和通量。將大視野與超分辨成像結合是Nanoimager的獨特優勢。
圖4 Nanoimager的大視野可以在高分辨率下實現高通量成像
超分辨熒光顯微鏡以其獨特的優勢，已成為生物醫學研究的重要工具。