新冠樣本準確度達91.4％陳德喜團隊提出基于mNGS的新方法

　　在大多數嚴重的急性呼吸道感染病例中，RNA病毒是主要病原體，如2019年12月以來的新冠病毒（SARS-CoV-2），已導致全球超過400萬人感染，超過30萬名患者死亡[1,2]。mNGS因無需培養、不依賴核酸序列、無偏好廣覆蓋的優點，在臨床疑似新發病原體、罕見病原感染、急危重癥、未知原因發熱等患者病原檢測應用有較多案例報道，國內專家共識推薦使用[3]。但是這種實驗室自建檢測方法由于缺乏方法標準化和實驗室分析性能和臨床性能的確認，阻礙了該方法在臨床的應用普及[4]。

來源：medRxiv

　　首都醫科大學陳德喜教授團隊基于illumina Nextera XT Tn5轉座酶直接切割RNA/DNA雜合鏈的特性[5]，優化mNGS建庫方法，并在NextSeq 500平臺上對該方法在臨床檢測呼吸道RNA病毒的各項性能指標進行了確認，包括低檢測限、精密度、穩定性、抗干擾能力以及SARS-CoV-2病毒檢測準確性等，為mNGS臨床實驗室常規檢測應用提供了數據參考和支持。5月14日，該研究成果發表在預印本medRxiv上[6]。

　　一般mNGS的RNA檢測流程包括逆轉錄、二鏈cDNA合成、預擴增/等溫擴增、cDNA片段化和PCR擴增等流程[7]。研究團隊通過優化RNA建庫步驟、縮短建庫時間，使mNGS操作簡便，更適合臨床使用。該團隊將這種簡便、快速、高靈敏度的檢測方法命名為CATCH（pathogeniCrnA/dna hybrid Tagmentation teCHnology）。CATCH可跳過二鏈cDNA合成，通過優化延伸和PCR步驟，將整個文庫制備過程縮短為3小時，人工處理時間為35分鐘（圖1）。該方法對SARS-CoV-2的檢測限為39.2拷貝/test，A型流感病毒為278.1拷貝/mL，其重復性、穩定性和抗干擾性都表現出了較好的性能（表1）。

圖1. CATCH工作流程示意圖。來源：medRxiv

表1. CATCH對A型流感病毒和SARS-CoV-2的檢測性能特征。來源：medRxiv

　　該方法理論上可以多重檢測所有RNA病毒，研究團隊選取了7種常見呼吸道RNA病毒，在接近檢測下限處設置病毒載量基線，基于健康人咽拭子VTM基質模擬7種病毒混合樣本，驗證了該方法的鑒別檢測能力。結果發現，CATCH不僅可以精確的鑒別7種病毒，并能對A型流感病毒進行亞型區分（圖2），研究還發現mNGS檢測信號與病毒濃度具有顯著相關性，說明該方法還可以達到半定量的效果（圖3）。

圖2.CATCH在RNA病毒檢測中的應用。（B）7種典型呼吸道RNA病毒：A型流感病毒（A / 2009 / H1N1）、B型流感病毒（B / Vitoria）、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腮腺炎病毒和風疹病毒的鑒別檢測和半定量。（C）3種典型的A型流感病毒亞型的鑒別檢測和半定量。來源：medRxiv

圖3.（B）qRT-PCR ORF1ab基因Ct值和mNGS檢測病毒信號的比較。（C）qRT-PCR N基因Ct值和mNGS病毒信號的比較。來源：medRxiv

　　研究團隊回顧性的納入了北京佑安醫院疫情期間的64位COVID-19患者的98個RNA樣本，同時采用CATCH和qRT-PCR兩種方法檢測。在47個雙基因陽性的qPCR結果中，44個mNGS檢測陽性的樣本中存在SARS-CoV-2信號。在11個單基因陽性樣本中，5個樣本中可檢測到SARS-CoV-2。此外，在40個qPCR檢測為陰性的樣本中，mNGS檢測結果仍為陰性。在這些樣本中，沒有其他DNA或RNA病毒被檢測為陽性。

　　總體而言，與qRT-PCR臨床檢測結果相比，CATCH的總體準確度為91.4％，靈敏度為84.5％，特異性為100％。如果僅考慮雙基因陽性樣品，其靈敏性將提高到93.7％（圖4）。由于各種原因，臨床樣本的核酸濃度成為制約mNGS的因素之一。研究團隊發現有相當一部分樣本提取RNA低于qubit檢測下限（65%，38.5%），無法滿足以往的mNGS建庫方法需要的起始量。CATCH方法可以超低起始量建庫，對于低于qubit檢測下限的RNA建庫樣本，成功率仍為100%。

圖4. CATCH與qRT-PCR檢測SARS-CoV-2的性能比較。來源：medRxiv

　　據悉，該研究為首次對基于Tn5轉座酶RNA快速建庫mNGS方法進行的分析性能確認。準確可靠的臨床性能驗證是mNGS作為常規診斷檢測推出之前必不可少的環節。該團隊期待其研究工作能夠為同行提供mNGS在臨床開展所需要的具體方案和詳實的數據，為mNGS病原檢測真正走進臨床助力。

　　參考文獻：

　　[1] Zhu N, Zhang DY, Wang WL, et al. A Novel Coronavirus from Patients withPneumonia in China, 2019. N Engl J Med 2020； 382:727-33.

　　[2] Wu F, Zhao S, Yu B, et al. A new coronavirus associated with human respiratorydisease in China. Nature 2020； 579:265-+.

　　[3] 宋振舉等.宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用專家共識組.宏基因組分析和診斷技術在急危重癥感染應用的專家共識[J].中華急診醫學雜志,2019, 028(002):151-155.

　　[4] Han D, Li Z, Li R, et al. mNGS in clinical microbiology laboratories: on theroad to maturity[J]. Critical Reviews in Microbiology, 2019(3):1-18.

　　[5] Di L, Fu Y, Sun Y, et al. RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNAhybrids. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020；117(6):2886‐2893.

　　[6] Laboratory validation of an RNA/DNA hybrid tagmentation based mNGS workflow on SARS-CoV-2 and other respiratory RNA viruses detection, medRxiv, May 14, 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.05.12.20099754

　　[7] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinicalmetagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid.Genome Res 2019； 29: 831-42.