一、交聯反應條件的優化不同方法得到的同種蛋白質復合體的質量與純度不同，因此建議進行各種實驗來摸索某一種蛋白質復合體的最優條件，但最好不要使用冷凍保存的蛋白質復合體（除非要進行特殊實驗），因為這樣常常會導致復合體的部分變性。較合理的安排是將所有的工作仔細計劃后，安排好并在幾天內完成，而在此期間可將蛋白質復合體于 4°c 保存。 1.（任選）若蛋白質復合體溶液的緩沖液中，含有不適合做交聯反應的組分，可使用凝膠過濾將其轉換為緩沖液 X。根據溶液的不同體積可選用 Bio-Spin 柱（50~100ul ）、Micro-SpinG-25 柱（10~100ul）或重力流驅動的 NAP 柱（0.1~2.5 ml)，具體可參照操作說明。 凝膠過濾步驟很簡單： （1）用緩沖液 X 平衡層析柱； （2）加樣； （3）收集洗脫液。 凝膠過濾法的除鹽效率一般為 95%~98%。舉例來說，含有 100 mmol/L Tris 的樣品溶液，在用這種方法除鹽后，溶液中仍殘留有 2~5 mmol/L 的 Tris。因此，要使緩沖液符合實驗要求，必須重復過柱。另一種除鹽的方法是透析，但耗時較長。 2.（任選）濃縮樣品。參照操作說明，可用超濾裝置快速（約 10 min) 而有效地使樣品得到濃縮。 為保證在進行⑩ 步操作時，有足量的蛋白質能加樣到膠上，對蛋白質溶液進行濃縮往往是必需的。在加樣之前，對凝膠洗脫液進行蛋白質沉淀來進行濃縮的效果要比使用超濾方法差，所以這里不推薦使用。為了減少由于超濾膜對蛋白質的吸附而造成的樣品損失，可以將膜用含 1mg/ml BSA 的緩沖液 X 沖洗 3 次，使膜在樣品濃縮前得到封閉。 3.將 13 支微量離心管置于冰上，并在每支管中加入 26ul 的蛋白質復合體溶液。 要點：為區分交聯反應的底物與產物，須做一個不加交聯劑的空白對照。
4.在天平上稱取 Img 左右的交聯試劑，將它們溶于預冷的 DMSO 或蒸鎦水中，制備成濃度為 10 mmol/L 的溶液。 EDC:1.9 mg/ml 蒸餾水 BS3:5.7 mg/ml 蒸餾水 BMH：2.8 mg/ml DMSO SMCC:3.3 mg/ml DMSO 要點：交聯試劑很容易迅速水解，因此應盡快完成操作。勿使用冷凍的試劑！ 5.用 10 mmol/L 的各種交聯試劑儲備液，在冰水中稀釋配制 lmmol/L 和 0.lmmol/L 的稀溶液。 6.將每種稀釋度（0.lmmol/L，1mmol/L，10 mmol/L) 的交聯劑各 3ul，加入含蛋白質復合體的小管中（見步驟③），以測定出最適宜的交聯劑濃度。 7.將小管在冰上 2°C 條件下孵育 lh。 8.加入 1ul 的終止液，使反應終止。繼續孵育 10 min。 9.每個樣品加入 4 X SDS 上樣緩沖液，在 70°C 水浴或加熱器上加熱 10 min。 10.用低濃度的 SDS-PAGE 膠分離蛋白質復合體的各組分（其中一些將發生交聯），其中應包括未加入任何交聯試劑的空白對照。 SDS-PAGE 凝膠的濃度，取決于交聯產物的大小，以及是否要對凝膠進行處理，聚丙烯酰胺的比例越小，凝膠就越易破裂，較好的比例為 6%，當然若待測定的蛋白質分子量較小，則不宜采用。為了增加低濃度膠的穩定性，可加入 1/6 體積 2% 的預聚合丙烯酰胺溶液。在凝膠上，加預染色的分子標記，可使電泳一直進行，直至已知的蛋白質分子走到凝膠底部為止，便于其他遷移較慢的分子能更好地分開。 11.分析出最適宜的交聯試劑及它的最佳濃度后，交聯反應條件的優化還包括： （1）設定不同的交聯反應時間：從 10 min 到 2 h; （2）設定不同的反應溫度：從 2°C 到室溫，每級溫度相差 5°C。 二、交聯產物的分離及進一步分析12.最佳交聯反應條件確立后，若需要，按步驟①和步驟②準備待用的蛋白質復合體樣品。 13.將選用的交聯試劑，加人蛋白質復合體樣品中，在最佳反應條件下孵育混合物。 要點：記得做一個只有蛋白質復合體而不含交聯試劑的對照。
14.重復步驟⑧~⑩。 若在 SDS-PAGE 后還要進行質譜分析，則在制備 SDS-PAGE 膠時必須考慮以下幾點：所有溶液必須是很干凈的，以避免角蛋白污染，最好使用剛剛過濾的溶液；對那些需要使用手套的步驟要特別注意，因為靜電電荷效應增加了污染的可能性，最終待測的蛋白質樣品，在凝膠上所占的體積要盡可能的小，這樣的凝膠做質譜分析時，靈敏度最好。而減小凝膠體積的方法包括使用空隙厚度為 Imm 的膠板制膠，盡量取得較好的分離效果（如可能，使用預制膠條按步驟? 精確切割條帶。 15.染色顯示蛋白質（見第 2 章，方案 2~7)。通過比較 SDS-PAGE 膠上加入與未加入交聯劑的樣品，找出含有交聯蛋白質的條帶。 16.精確切下感興趣的條帶，并用質譜進行分析（見第 2 章方案 1)。 雖然待檢的蛋白質發生了交聯，但無須采用特殊的預備措施，只需盡可能地減少消化（第 7 章）緩沖液的用量，以保證上清中肽片段濃度足夠大，這樣在質譜分析前就可以不用對樣品進行抽提，從而避免肽片段的損失。
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