實驗材料 韌皮部汁液
試劑、試劑盒 HClNaOH丙酮甲醇DTTβ-苯巰基乙醇
儀器、耗材 刀片螺旋蓋試管
實驗步驟
3.1 收集木質部汁液
木質部汁液屬于植物細胞外空間，含有的特殊蛋白質的種類和濃度隨植物的狀態而變化。因為純凈的木質部汁液容易從大多數植物中得到，所以容易用蛋白質組學工具進行木質部汁液蛋白質的鑒別。準備進行單向電泳（1- DE) 或雙向電泳（2- DE) 分離的蛋白質樣品時，要考慮到蛋白濃度很低，且含有低聚糖（及糖基化蛋白）。用 1- DE 或 2- DE 進行木質部汁液蛋白質樣品分析，有兩個基本步驟，即收集木質部汁液和濃縮蛋白質。
( 1 ) 用刀片切割植物的莖，收集從根側莖中自然流出的汁液（由于根壓流出）（圖 4-1)。植物的莖可以在任何髙度被切割，不過通常來講，切割部位離莖基部越近，流出的汁液量越大。但是蓮的切口要達到一定高度（大約 10 cm) 以便連接一個放在冰中的管子（見注釋 1)。
( 2 ) 汁液收集。
a. 將剩下的莖段水平放置，把一根管子接在切口處。管子放在一個裝有冰塊的容器中，然后收集汁液達 6 h ( 圖 4-1C；在汁液收集的過程中，容器冰塊需補充；見注釋 2 ) 。
b. 另一種方法是，滲出的木質部汁液可以每隔幾分鐘用移液管重復收集，液體收集到放置在冰塊上的反應管里。
( 3 ) 收集汁液前要清洗切口，以除去被切細胞的細胞質和切割韌皮部時直接流出的汁液（見注釋 3) 。
( 4 ) 在濃縮蛋白質前，可以用離心的方法除去顆粒狀物質，像土壤顆粒、微生物細胞或殘留的組織。
3.2 濃縮木質部汁液蛋白
木質部汁液不但含有蛋白質，也包含碳水化合物（見注釋 4 ) 和其他化合物，如氨基酸、鹽及多酚（在被病原體侵染的植株中 )。
如果進行 1-DE，簡單的蛋白質沉淀就可以，甚至可以用乙醇（4 份 95% 乙醇/5% 0.1 mol/L NaAc 加入 1 份蛋白質樣品中），盡管乙醇也可以沉淀多聚和低聚糖。
如果進行等電聚焦，汁液應該用 Amicon 過濾裝置進行部分提純和濃縮，之后用 TCA /丙酮進行沉淀。
1. 用 Amicon 過濾裝置進行蛋白質的部分提純和濃縮
用 Amicon CentriprepYM-3 離心超濾濃縮器（最多 15 ml，自動開關：3kDa) 和 ( 或）Amicon Centricon Plus-20 離心超濾管（更大的容積，自動開關：10kDa) 過濾裝置 ，對木質部汁液進行濃縮及部分提純。
( 1 ) 離心后除去微粒狀物質，將最多 15 ml ( AmiconCentriprepYM- 3 ) 或者 19 ml ( Amicon Centricon Plus-20 ) 木質部汁液加入樣品容器中。
( 2 ) 在 4°C、3000 g 旋轉 Amicon Centriprep YM -3 75 min 直到達到平衡（過濾收集器里外液面之間）。
( 3 ) 在 4°C 旋轉 Amicon Centricon Plus-20，4000 g，15 min。輕輕倒出濾液，再加入 19 ml 木質部汁液到樣品過濾杯中。
( 4 ) 再旋轉 15 min。
( 5 ) 輕輕倒出濾液，如果需要進一步濃縮，則重復旋轉和倒出濾液的步驟。
( 6 ) 直接從 Centriprep YM-3 中收集濃縮液（至少 500 μl )。
( 7 ) 在 1000 g 旋轉倒置部分（inverted unit) 5 min，從 Centricon Plus-20 收集濃縮液（至少 200 μl ) 。
2. 用 TCA / 丙酮沉淀蛋白質
( 1 ) 將 4 份 100% 丙酮溶液（含 12.5% TCA 和 0.0875% β-巰基乙醇）加入 1 份蛋白質中，并混合。
( 2 ) 在 -20°C 反應 45 min 以上（或用 80% 丙酮在 0°C 反 應 1~4 h) ，然后用離心機的最快速度離心 30 min ( 不需冷凍）。
( 3 ) 棄掉上清液，并用冰冷的 100% 丙酮漂洗沉淀 3 次。
( 4 ) 除去殘留液體，室溫晾干沉淀。沉淀可溶于重懸緩沖液（2 mol/L 硫脲、7 mol/L 尿素、4% CHAPS、2% mmol/L DTT )[ 5 ] 后用于等電聚焦，或保存在 -20°C。
3.3 收集韌皮部汁液
韌皮部汁液比木質部汁液更難從大部分植物體中收集。因此，韌皮部汁液蛋白組學的主要難題是收集足夠多的材料。不過，可根據不同植物物種的特性應用不同的采集方法。
對于一些植物物種（如蓖麻、葫蘆科植物、絲蘭），切小切口或割開整個植物器官 [18] 可以收集韌皮部汁液。不適宜這種收集方法的植物可以通過 EDTA 輔助分泌法 [ 19~21] 取樣。許多植物都可以用蚜口針技術 [ 22 ] 得到高純度的韌皮部汁液，但是量很少。
已經被確立的模式植物，像擬南芥或是水稻，很難采集到足夠量的篩管分子滲出液用于蛋白質組研究。對于擬南芥而言，可得到的樣品量不足以用于蛋白質組學的研究方法 [ 10] ，對于水稻而言，只有一些高豐度的韌皮部汁液蛋白質能夠通過 planthopper 口針滲出液 [ 6，23] 被鑒別出來。大部分目前關于鑒別韌皮部多肽的信息來自于葫蘆 [ 8 ] 、蓖麻 [ 10] ，最近又從油菜 [ 7 ] 得到了相關信息。
收集這些植物的韌皮部汁液要相對容易。兩種版本的滲出技術（exudation technique) 描述如下所述。
1 . 版本 1
( 1 ) 用刀片切割植物的主莖或葉柄（圖 4-2)。
( 2 ) 將注射針頭穿刺植物體（見注釋 5) 。
2 . 版本 2
( 1 ) 切割后使用地上部分一側的斷蓮，用濾紙吸干切口（見注釋 6 )。
( 2 ) 用濾紙吸去最先滲出的液滴。
將隨后滲出的汁液吸取收集到一個保存在冰中的反應管（見注釋 7)。
3.4 韌皮部汁液蛋白質的提純
( 1 ) 在 1-DE 或 2-DE 中分離韌皮部蛋白質時，必須考慮到運輸液中的高濃度糖和有機物。另外，植物對切割有御傷機制，其中包括蛋白質聚合作用 [ 24 ]。
( 2 ) 對于 1-DE 來說，韌皮部樣液可以被直接加進 1-DE 樣品緩沖液「25」，加熱，并在室溫下進行凝膠電泳。
( 3 ) 對于 2-DE，在樣液用于進行等電聚焦電泳之前，蛋白質應該通過沉淀的方法提純。
1. 去除韌皮部主要的蛋白質 1 ( PP1 ) 和蛋白質 2 ( PP2)
兩種主要的韌皮部蛋白質——韌皮部絲狀蛋白 PP1 和韌皮部凝集素 PP2 存在于所有雙子葉植物中，并在一些植物中占全部韌皮部蛋白質的 50% 以上（如葫蘆科植物）。
在氧化條件下，兩種蛋白質通過二硫鍵形成不溶性聚合物 [ 26，27] ，它們會在 1-DE 和 2-DE 中形成拖尾，使分辨率下降。要移除這些蛋白質，可以使用先酸化再中和的方法 [28] 。以下的所有步驟都在室溫下完成。
（1 ) 用 2 mol/L HCl 標定樣液到 pH 2.0。
( 2 ) 用 2 mol/L NaOH 中和樣液到 pH 7.5。
( 3 ) 在 15 000 g 離心 15 min。
( 4 ) 收集上清液并去掉含有 PP1 和 PP2 的大量白色沉淀（見注釋 8) 。
2. 用丙酮/甲醇/ DTT 沉淀全部初皮部汁液蛋白質
要移除碳水化合物和其他干擾成分，可以用丙酮/甲醇/DTT 處理使蛋白質沉淀。
( 1 ) 加入 3 倍體積預冷沉淀液。
( 2 ) 在 -20℃ 沉淀一夜（見注釋 9) 。
( 3 ) 在 6800 g、4°C 離心 5 min ( 見注釋 10 ) 并丟掉上清液。
( 4 ) 用 100% 預冷丙酮漂洗沉淀物兩次，并在 6800 g 4°C 離心 5 min。
( 5 ) 除掉上清液，室溫晾干沉淀 5~10 min ( 見注釋 11)。
( 6 ) 將沉淀在樣品緩沖液中被溶解，用于 1-DE 和 2-DE ( 見注釋 12)。