雜化顆粒C18色譜柱和乙酸流動相進行肽的高載量研究二

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結果與討論
含有九種組分的肽混合物的載量研究
在之前的研究中，已經對CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在分析型肽分離中的應用(例如肽圖繪制)進行了廣泛的探討^8-9。簡而言之，與其他肽分離反相填料相比，CSH130 C₁₈及其創新的表面帶電技術能夠改善峰形和載量。在分析型應用中，尤其是在流動相含有極少或不含離子對試劑時，可以觀察到峰容量有顯著升高，最高達到90%。與BEH130 C₁₈相比，CSH130 C₁₈的表面正電荷還提供了獨特的選擇性和較低的保留性，使得它們成為肽分離色譜填料的絕佳搭配。

為了研究CSH130 C₁₈和BEH130 C₁₈在制備型分離中的表現，采用生產中常用的流動相(即含有TFA或HOAc的流動相)對一系列不同肽進行了載量研究。這些方法開發實驗中使用的是5μm顆粒填充的分析柱(4.6mm內徑)。

首先在這些色譜柱上進行測試的是MassPREP肽混合物，其包含九種不同的肽，如表1所示。圖1所示為該混合物在半制備型上樣下的一組色譜圖，其中使用了BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈，以及兩種不同的流動相，一種含有0.1%TFA，另一種含有0.1%HOAc。使用0.1%TFA時，BEH色譜柱的平均4峰寬為0.8min。使用0.1%HOAc時，平均峰寬幾乎翻了一倍，達到1.5min。HOAc的酸性比TFA弱得多，從而導致流動相酸性減弱，離子強度和離子配對能力均顯著降低。因此預計使用HOAc代替TFA時，大部分C₁₈柱的峰形會較差。這一假設對于BEH130 C₁₈的半制備型上樣是成立的，如圖1所示。然而對于CSH130 C₁₈色譜柱，用HOAc替換TFA時峰形仍保持良好。使用0.1%TFA流動相和0.1%HOAc流動相時，在CSH130色譜柱中觀察到的平均4峰寬分別為0.5和0.6min。峰寬數據匯總于圖2中，其中分別繪出了在不同色譜柱類型和流動相條件下混合物中每種肽的峰寬。除了半制備型上樣量的數據之外，圖中還顯示了分析型上樣量的數據。此圖表明BEH130 C₁₈和CSH130 C₁₈在一些條件下會生成類似的肽峰形，包括0.1%TFA的分析型上樣量。但是，在其他條件下，例如0.1%HOAc的半制備型上樣量，CSH130 C₁₈生成的峰要窄得多。正如之前研究所證實^8-9，CSH130 C₁₈在使用含有極少或不含離子對試劑的酸性流動相時，獲得的肽峰形明顯更好。同時也表明，當上樣量高于常規分析20倍時，這種現象更為明顯。

低純度合成肽
制備型分離往往要求上樣量必須達到(有時要高于)分析型分離所用上樣量的1000倍。使用序列為DFVGYGVKDFVGVGVK的低純度合成肽(一種中性肽，pI=6，1.7kDa)，對低于此范圍和此范圍之內的上樣量進行研究。在BEH和CSH色譜柱上采用聚焦梯度分離以縮短運行時間，使用低靈敏度波長(250nm)檢測以獲取完整峰形。

首先使用經0.1%HOAc調節的流動相對半制備型和制備型上樣量進行分析，如圖3所示。BEH色譜柱上的半制備型上樣量(50μg)產生的目標肽峰帶有明顯拖尾，這與常見的Langmuirian等溫線一致。相反，在制備型上樣量(1mg)下，目標肽的洗脫峰呈略微前伸，正如典型的anti-Langmuirian等溫線。我們知道，當肽以兩性離子形式存在時，就會出現anti-Langmuirian等溫線¹⁰。由此可知，經0.1%HOAc調節的流動相酸性不足以將這種合成肽的羧基完全質子化，肽可能同時以陽離子和兩性離子存在。兩性離子的相對含量應隨上樣量增大而增大，尤其是在目標肽濃度超過流動相的質子化/緩沖能力情況下。這就解釋了BEH色譜柱上樣量增大時峰形出現的巨大變化。

有趣的是，正如在圖3中所看到的，對于BEH130 C₁₈，在制備型上樣量下使用0.1%HOAc似乎更容易獲得較窄的目標肽峰。在這些條件下，BEH色譜柱得到的目標肽峰比CSH色譜柱更窄。事實上，CSH130 C₁₈使用0.1%HOAc時在兩種上樣量下都獲得了前伸峰。由于其表面所帶的正電荷最大程度地減少了肽的拖尾，所以出現這種情況是意料之中的^8-9。因此，前伸峰形也更加明顯。由于沒有拖尾峰，制備型上樣量下CSH柱的目標峰寬度實際上要大于BEH柱。