實驗概要
滾動式循環放大(RCA)法是一種能夠在恒溫條件下，使標記有寡核苷酸探針(與組織細胞內的核苷酸無相關性)的抗體(特異性一抗或第二抗)與組織細胞內的抗原結合后，在DNA聚合酶的作用下，加入的寡核苷酸進行循環擴增，產生一條擴增的DNA序列拷貝產物，此時，標記在抗體上的寡核苷酸得到有效擴增(109倍)，擴增后的產物與后續加入的標記有示蹤物的寡核苷酸進行互補雜交，在抗原-抗體周圍形成眾多帶有標記示蹤物的雜交體，最后通過IHC方法再放大示蹤物。該方法具有很高的敏感性和特異性。首先要合成三條寡核苷酸探針(引物)，然后將寡核苷酸與抗體結合，最后進行RCA免疫組化染色。
左上為寡核苷酸標記的特異性抗體與組織細胞內的特異性抗原結合；右上為DNA聚合酶作用下與放大抗體分子上結合的核苷酸；左下為用標記示蹤劑的寡核苷酸進行互補雜交；右下為用IHC方法進一步放大檢測。
實驗步驟
1.寡核苷酸的合成與抗體連接寡核苷酸
1) 標記抗體用寡核苷酸
5’-AAAAAAAAAAAAAAAAATGATCACAGCTGAGGATAGGACATGCGA-3’
2) 循環放大寡核苷酸
5’-PCGCATGTCCTATCCTCAGCTGACAGAACTCACCTGTTAGACGCCACCAGCTCCAACTGTAAGATCGCTTAT-3’
3) 帶有標記物的互補檢測用寡核甘酸
5’-XACTGTGAAGATCGCTTATX-3’(X=生物素)，或用5’-FACTCTGAAGATCGCTTATF-3’(F=熒光素)；或用5’-HRPACTGTGAAGATCGCTTATHRP-3’(HRP=辣根過氧化物酶)。
2. 寡核苷酸與抗體的結合
連接用的抗體可以是特異性一抗，也可以是第二抗體或其他的連接二抗，如抗地高辛(Dig)、抗熒光素(FITC)或抗生物素(biotin)二抗。
1) 抗體的脫鹽和活化
首先對抗體免疫球蛋白進行脫鹽，然后進行抗體活化。在41 nmol抗體分子中加入410mmol的GMBS[硫代-N-(4-馬來酰亞胺丁酰)硫代丁二酰亞胺，sulfo-N-(4-maleim-idobutyryloxy)sulfosuccinimide]，暗處，37℃，在氮氣中30 min，移人室溫中繼續反應30min，用PD-10色譜柱(用pH7.5 PBS平衡柱子)除去多余的磺化-GMBS，將活化抗體4℃濃縮。此時每一個抗體分子中含有多個馬來酰亞胺，可以用Ellman’s試劑滴定活化抗體的量，主要測定抗體分子上的巰基。抗體活化后與寡核苷酸連接。
2) 活化抗體與寡核苷酸結合
將28.1nmol磺化GMBS活化抗體和142 nmol硫醇寡核苷酸混合，總體積為825ul，室溫中反應2h，隨后移人4℃中反應過夜。
3) 純化結合物
純化結合物一般先用陰離子交換色譜柱Q-sepharose(先用梯度鹽洗柱，然后加樣，洗脫，收集結合物)，再用SephadexG-200色譜柱除去游離的寡核苷酸。純化后結合物中寡核苷酸和抗體之比為10:1，多數情況下，1個抗體分子可結合3～5個寡核苷酸。
3. RCA免疫組化染色
1) 石蠟切片常規脫蠟至水，抗原修復后，PBS洗3×3min。
2) 滴加特異性一抗，37℃孵育1h，PBS洗3×3min。
3) 滴加適當稀釋的寡核苷酸標記二抗IgG 200nmol/L(用100mmol/L谷氨酸鉀-PBS稀釋)，37℃孵育30min，PBS洗3×3cm，用100mmol/L谷氨酸鉀洗。
4) 循環寡核苷酸(170mmol/L)，用φ29緩沖液稀釋[緩沖液內含250mmol/L(pH7.5)Tris-HCl，50mmol/L MgCl2，lmg/ml BSA，lmmol/L dATP，lmmol/L dCTP，lmmol/LdGTP，0．75 mmol/LdTTP，0．25mol/LFITC-12-dUTP]，40ul/每片，37℃孵育30min，不洗，每張切片加入1ulφ29 DNA聚合酶(0.4U/ul)，37℃繼續反應30min，PBS洗3×3mino．
5) 免抗FITC-AKP結合物1:1000稀釋，37℃30min；PBS洗3× 3min；0.02mol/LTris-HCl(pH9.0內含氯化鎂、左旋咪唑)洗20min。
6) NBT/BCIP顯色30～240min，核固紅襯染。
7) 常規樹膠封片，結果觀察。