實驗方法原理
凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動，比低分于量蛋白更早地被洗脫下來。最大的蛋白質分子最早流出柱子，因為它們在到達柱底前經過的體積最小。中等大小的蛋白質可以進人填料分子中較大的孔內，因此它們晚一些到達柱底，而小蛋白質可以逬人所有填料的孔內，有最大的通過體積，故最后到達柱底。
實驗材料 蛋白質溶液
試劑、試劑盒 緩沖液藍色葡聚糖溶液乙醇乙腈乙酸胃蛋白酶
儀器、耗材 低壓層析系統
實驗步驟
1. 凝膠的填裝
1.1 凝膠的溶脹
如果凝膠是脫水的干粉（例如 Sephadex）在使用前需要溶脹。
1.1.1 一份凝膠加 10 份的緩沖液，原則上應將凝膠顆粒放入洗脫緩沖液中。
1.1.2 在搖床上或手動攪拌混合，避免使用電力攪拌器。因為機械攪拌力會導致凝膠顆粒破裂成碎片，這些細小的碎片將干擾層析。如果出現細小的凝膠碎片可將凝膠漿懸浮，待凝膠顆粒沉降后，去除上清，重復幾次，直到液相不再混濁為止。
1.1.3 自然溶脹需要 24 h 至數天，為了加速溶脹，可用熱法溶脹。即在沸水浴中將凝膠漿逐漸升溫至近沸，這樣可加速溶脹平衡，通常 1～2 h 即可完成。這種方法不但省時，還可以排除氣泡和消毒。
1.1.4 無論凝膠是否需要溶脹，為了防止氣泡影響層析，需用水泵或真空泵對凝膠漿抽氣 1 h。
1.2 裝柱
1.2.1 將層析柱垂直安裝在無直接光照、無空氣對流處，以防止由于溫度變化使層析柱內產生氣泡。通常放在專用的層析冷柜中；
1.2.2 裝柱前取 3/4 體積的凝膠和 1/4 體積的緩沖液制成凝膠漿；
1.2.3 對于經常使用的層析柱，建議使用一個商品化的流動相接頭（flow adaptors）。它對柱床表面有保護作用，還可以避免樣品中的大顆粒混入凝膠中，從而延長層析柱的壽命；
1.2.4 將緩沖液加入層析柱，當有緩沖液流出時關閉柱的出口。這樣可以排除層析柱中支撐濾片以下空隙中的氣泡；
1.2.5 沿柱子一側或沿一根玻璃棒傾入凝膠漿，必須一次完成，否則柱床不均一；尤其要注意在裝柱過程中不要產生氣泡，如果在裝柱早期出現氣泡，可用一玻墑棒攪動，使氣泡排出；
1.2.6 當凝膠裝到柱底之后，打開柱底出口以加快裝柱進程，隨之加入更多的緩沖液；
1.2.7 將層析柱與蠕動泵和貯液器相連接，用幾倍柱床體積的緩沖液洗滌層析柱，以使其穩定和平衡；
1.2.8 SephacrylHR 和 Superose 凝膠以不同的流速分兩步裝柱（詳見便用說明書）；
1.2.9 注意任何時候都不得使層析柱緩沖液流干，這樣就不能進行正常層析分離了。
1.3 層析床的檢查
因為氣泡和層析柱的不均一性會明顯降低層析分辨，所以在層析前必須仔細地檢查層析床的均勻性。
1.3.1 用眼對光觀察層析柱有無氣泡和裂紋。
1.3.2 用 2 mg/ml 藍色葡聚糖溶液進一步精確檢查層析床的均勻性。用量為柱床體積的 1％， 兩倍用量的洗脫液即可將藍色洗脫下來。常用洗脫液為 0.02mol/L 氯化鈉。如果連接實驗時，必須避免鹽的存在，則可再用水洗脫。若微量的藍色葡聚糖吸附于凝膠表面時，常用血清白蛋白溶液洗脫。
藍色葡聚糖的藍色是顯而易見的，如果柱子裝的好，可見到藍色區帶均勻平穩地通過凝膠，而不留任何條紋。
如果是 Bio-Gel P 柱，也可用血紅蛋白和鐵蛋白代替藍色葡聚糖作為檢查用的標準參照物。因為它們也是有色蛋白。藍色葡聚糖也可用于測量層析柱的外水體積。 外水體積是指不能進入凝膠中的任何微孔的大顆粒物質從柱上洗脫下來的所需的洗脫液體積，外水體積是蛋白質可能從柱上被洗脫下來的最小必需體積，它可以作為預測其他蛋白質所需洗脫液用量的相對標準。
2. 樣品上柱及洗脫
2.1 樣品上柱
2.1.1 蛋白質樣品應該高度濃縮（10～20 mg/ml）， 體積應盡量小（適當的上樣量為柱床體積的 1％～5％），上樣量高于柱床體積的 5％，則將降低分離效果。而低的柱床體積并不提高分離效果，此外樣品黏度不能太高，否則會使層析區帶不穩定和流速無規律，導致區帶變寬或歪曲。
2.1.2 上樣前，樣品須經孔徑內 0.2 um 的濾膜過濾或在 10 000×g 離心 5 min，以除去干擾層析的殘渣。
2.1.3 選擇的緩沖液應該有利于蛋白質活性的保持并可防止非特異的蛋白質之間或蛋白質與凝膠之間的相互作用。一般低離子強度的鹽溶液（20～100 mmol/L）， 足以阻斷非特異的離子間相互作用。在某些情況下，蛋白質與凝膠之間會產生疏水性相互作用，這時不應該用高離子強度的鹽溶液。
層析柱經平衡后，待平衡液流至床表面以下 1～2 mm 時，關閉出口。不允許流干, 柱干后必須重裝；
用加樣器將樣品加至柱床表面以上 2～3 cm 時，接上恒壓樣品瓶，并打開出口，使樣品滲膠內。樣品加完后，用小體積的洗脫液洗表面 1～2 次，盡可能少稀釋樣品。當樣品接近流干時，像加樣品那樣仔細地加入洗脫液，至床表面以上 2～5 cm 時，即可接上恒壓洗脫瓶開始層析。以上所有操作步驟都須時刻注意層析表面的均勻性。
2.2 樣品洗脫
2.2.1 緩沖液流經層析柱進行洗脫直至目的蛋白被檢出為止；
2.2.2 通常用蠕動泵控制層析柱的流速。 使用泵的壓力不要超過凝膠的耐受程度；
2.2.3 由于凝膠過濾層析經常需要進行數小時以上，為了避免層析柱流干，在不使用蠕動泵時，可在貯液瓶與層析柱上端入口入加一根軟管其長度與柱的出口處持平，使緩沖液先流經軟管再到達柱內。
2.2.4 理想的樣品回收率可高達 85％ 以上；
2.2.5 低流速可提高峰的分辨力；
2.2.6 關于蛋白質分子量測定（主要是非變性條件下的球蛋白）可以通過對蛋白質標準品的凝膠過濾柱層析來解決。但此法不能用于變性條件下的分子量測定。用標準蛋白的冼脫體積對其分子量的對數作圖得到一條標準曲線。用未知蛋白的洗脫體枳到標準曲線上可査出相應的分子量。
3. 層析柱的再生與保存
由于凝膠不可能與蛋白質結合，因此從凝膠上除去蛋白質不是一件難事。通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑清洗可除去大部分的結合物質。然而避免層析柱污染的最有效方法是進樣前將樣品過濾以及用新過濾的緩沖液迸行層析。如果經過以上標準程序洗滌，某些污染物仍不能清除時，可從柱中倒出樹脂，按下述方法進行特殊處理后，再重新裝柱。用 24％ 乙醇或 30％ 乙腈對層析柱洗脫過夜可除去疏水蛋白；用 30％～50％ 乙酸洗脫或用 1 mg/ml 胃蛋白酶（溶于 0.5mol/L NaCl 和 0.1 mol/L 乙酸）將層析柱內凝膠孵育過夜可去除親水蛋白。用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量胃蛋白酶。用 TE 緩沖液，（10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.2）洗滌或用核酸酶處理可去除核酸。層析柱用非離子型去垢劑如：0.2％～1％ NP-40 或 Lubrol 洗脫過夜可洗去脂類物質。
層析柱須保存于含防腐劑的緩沖液中并放置在低溫環境下，這樣有助于防止微生物滋生。通常在緩沖液中加入 0.02％ 疊氮鈉可防止微生物生長。Sephacryl HR 或 Sepharose CL 可用 20％ 乙醇保存。有些凝膠可采用高壓滅菌防止微生物生長。
注意事項
1. 加樣時不能用一般滴管，要用下口較大的滴管，以免滴管頭所產生的壓力攪混柱床表面。
2. 加樣操作要熱練而仔細，避免攪混往床表面。在平衡時柱床表面常常會出現凹陷現象，因此必須檢杳柱床表面足否均勻，如果不符合要求，可用細玻璃棒輕輕撥動表面層，讓凝膠自然沉降，便表面均勻。
3. 加樣品的方法是利用兩種液體比重不同的分層的原理，將高比重樣品加入床表面低比重的洗脫液之中，樣品就緩慢均勻地下沉于柱床表面。再打開出口，使樣品滲入層析床。如果樣品比重不夠大時，可在樣品中加入葡萄糖或洗精使其終濃度達 1％。