灌注固定法

實驗概要

出于多種考慮，將小組織片段簡單浸泡在固定液中便能得到合適的固定，而且對大多數組織來說這可能是唯一的固定模式。然而更快、更均一的固定方法是將固定液通過管道系統如心主動脈或腹部主動脈灌輸到組織中。下面介紹一下用 4% 多聚甲醛固定大鼠大部分器官的操作過程。

主要試劑

0.9% 生理鹽水

500 ml 燒杯

4% 多聚甲醛、固定液

主要設備

麻醉劑

手術用剪刀、鑷子、止血鉗

小鑷子

手術刀

帶塞子的樣品瓶 (5-10 ml)

手套、防護眼鏡

蠕動泵（或將燒瓶口向上固定在距手術臺上方 150 cm 處）

心主動脈灌注用輸液針，長 50 mm，外徑 1.3-1.5 mm

帶有靜脈輸血用的滴注腔的灌注裝置

實驗步驟

1. 心臟灌注固定法

1) 設置蠕動泵，連接灌注裝置和輸液針。取  100 ml 水沖洗管道除去管內殘留物，然后燒杯盛滿 4%  多聚甲醛（冰盒預冷），將灌注管開放的末端置入燒杯。溶液體積應該與動物大小成比例，通常一只動物 100-200 ml 足夠。打開閥門，調節流速  (20 ml/min)，緩慢且穩定，然后關閉閥門。

2) 找出剪刀、鑷子和止血鉗的手術操作部位。給動物注射合適劑量的麻醉劑。動物處于麻醉狀態后，將其背部向下平放在操作臺上。可以用帶子固定動物。

3) 用捏反應法檢測麻醉程度。在開始下述操作之前確保動物是無反應的。

4) 手術刀沿腹部膈肌縱向切一手術切口，并用剪刀剪開膈肌底部粘連的組織確保能進入胸腔。

5) 取大號剪刀，鈍端向下，切穿左胸肋廓。

6) 橫向切穿胸廓一到兩厘米，打開胸腔。用止血鉗將心臟暴露出來。準備排血和輸液裝置。

7) 用鑷子穩定心臟（心臟應該還在跳動），在左心室跳動部位直接插入針頭，垂直外露 5 mm。注意針頭不要插入太多，以防刺破心室壁影響溶液循環！用止血鉗將針頭固定在輸入口。松動閥門，使 0.9% 生理鹽水保持緩慢、穩定的流速，大約 20 ml/min。

8) 用剪刀在心房處剪一口，保證溶液自由流動。如果溶液不能自由流出或從動物的鼻孔或口腔流出，則要讓針頭復位。

9) 當血液快排干凈時，換上 4% 多聚甲醛溶液 (200-300 ml)。

10) 終止灌注，切除靶組織，放置到盛有同種固定液的小瓶中，冰上或 4 °C 固定 2 小時，再脫水包埋。4 °C 浸泡過夜固定，效果更好。

2. 腹主動脈灌注法

1) 按上述方法準備材料和動物（步驟 1-3）。

2) 沿腹部中線橫向剪開一長切口，打開腹腔，將腸道輕輕推至腹腔左側。

3) 小心地將腎主動脈起始端下方的主動脈露出。輕輕地將腹主動脈與覆蓋其上的脂肪及其它粘聯組織剝離開。

4) 用鑷子將距遠端 0.5-1.0 cm 分岔處的主動脈壁牢牢地固定住。然后將折針緊貼鑷子插入主動脈腔。

5) 快速連續操作以下步驟：

            a. 用小剪刀在下腔靜脈剪開一個口。

            b. 開始灌注。

            c. 夾住膈肌下方，腎主動脈起始端上方的主動脈。

6) 腎臟表面呈現顏色均一、變淺發白時表明灌注完成。灌注一只成年大鼠，流速要控制在至少  60-100ml/min，灌注 3 分鐘。終止灌注，切除并清理靶組織，并將之放置到盛有同種固定液的小瓶中（見后面的固定步驟），冰上或 4 °C  固定 2 小時。4 °C 浸泡過夜固定，效果更好。

7) 脫水包埋組織。