生化分析儀的標準參數設置

　　1.1 終點分析法

　　1.1.1 一點終點法

　　該法的特點是使用一種或兩種試劑，待測定物與試劑反應達到終點時，測定吸光度，計算待測物的濃度。該法常見的有總蛋白雙縮脲法、白蛋白溴甲酚綠法、葡萄糖氧化酶法。

　　1.1.2 兩點終點法

　　也稱固定時間法。在單試劑分析中，該法可以消除樣品以及試劑的顏色、濁度的干擾，其原理是在樣品與試劑混合后的延滯期后讀取一個點A1，一定時間后讀取A2，ΔA=A2-A1，然后比較標準和測定的ΔA值，求得待測物的濃度。單試劑分析常見的有肌酐苦味酸法。在雙試劑分析中，該法還具有消除內源性物質測定的干擾，其原理是加入試劑1后讀取A1，加入試劑2后讀取A2，A1相當于讀出樣品空白值，A2才是實際呈色反應，因此ΔA=A2-A1。

　　1.2 連續監測法

　　其原理是在酶促反應的最適條件下，用物理、化學或酶促反應的分析方法，在反應速度恒定期（零級反應期）來連續觀察和記錄一定反應時間內底物或產物量的變化，以單位時間酶反應初速度計算出酶活力的大小和代謝物的濃度。其具體方法有兩點速率法和多點速率法。 織夢內容管理系統

　　1.2.1 兩點速率法

　　觀察在零級反應期內兩個時間點的吸光度，用兩個點的吸光度的差值（ΔA）除以時間（分），計算出每分鐘的吸光度變化值。

　　1.2.2 多點速率法

　　在酶促反應進程的零級反應期內每隔一定時間（2-30s)進行一次監測，連續監測多次，求出單位時間內的反應速度。

　　1.3 比濁測定法

　　自動化生化分析儀一般只能做透射比濁分析，其原理是在光源的光路方向測量透過光強度，它常用于終點法測定，目前應用較多的為免疫透射比濁法。目前主要用于血清特種蛋白的檢測，如載脂蛋白、微量蛋白、急性時相反應蛋白、免疫球蛋白以及某些藥物監測等。

　　 溫度

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　　一般生化分析儀的恒溫控制器可以對25℃、30℃、37℃三種溫度進行恒溫，根據需要可以任意選擇。由于酶在達到最適溫度以前，溫度每升高10℃，反應速率增加1-2倍，因此IFCC推薦酶測定時的溫度設置為37℃。 本文來自織夢

　　波長

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　　3.1 單波長

　　當測定體系中含有一種組分或在混合溶液中待測組分的吸收峰與其他共存物質的吸收波長無重疊時，可選用。如果一個物質有幾個吸收峰，可選用吸光度最大的一個波長，或者選擇在吸收峰處吸光度隨波長變化較少的某個波長。

　　3.2 雙波長

　　當被檢溶液混濁或存在較多的干擾物質時，測定時會出現光散射和非特異性光吸收，從而影響測定結果的準確性，此時可用雙波長測定，以提高測定結果的準確性，而在實際應用中選擇輔助波長主要用于消除脂血、溶血、黃疸的干擾。由于脂質、血紅蛋白、膽紅素在較寬的波長范圍內有較強的光吸收，常常同測定波長有重疊，此時測得的吸光度包含待測物質的吸光度和干擾物質的吸光度，因此選用合適的輔助波長可以消除干擾物質的吸光度。輔助波長的設置原則是根據測定波長選擇輔助波長，要求干擾物質在測定波長同輔助波長有相同的吸光度。

　　樣品量和試劑量

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　　樣品和試劑量的設置原則一般是根據試劑說明書上的比例，并結合儀器的特性進行設置。儀器的特性包括：樣品和試劑的最小加樣量及加量范圍、最小反應液的體積等。在實際工作中為節約成本可以根據比例縮小樣品和試劑用量，但同時必須滿足最小反應液總量。但值得注意的是，樣品量不應少于3μl，否則測試結果的重復性差。

　　 稀釋水量

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　　添加樣品稀釋水的目的是為了洗出粘附在采樣針內壁上的微量血清，減少加樣誤差，添加試劑稀釋水的為了避免試劑間交叉污染，兩種稀釋水的量應在復溶試劑時按比例扣除。如用液體試劑盒時因不再加水，無法扣除稀釋水量，所以兩種稀釋水的量應盡量減少，以免試劑被過量稀釋。

　　孵育時間

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　　在終點分析法中，孵育時間的選擇應充分考慮到干擾問題。在白蛋白溴甲酚綠法中，血清中α1-球蛋白、轉鐵蛋白、觸珠蛋白等亦可與溴甲酚綠呈色，但其反應速率較白蛋白為慢，而實際上，當血清與白蛋白混合時，“慢反應”已經發生，因此在溴甲酚綠與血清混合后30s讀吸光度可明顯減少非特異性結合反應。在葡萄糖氧化酶法中，葡萄糖氧化酶高特異性催化β-D-葡萄糖，而血清中葡萄糖α和β構型各占36%和64%，要使葡萄糖完全反應，必須延長孵育時間使α-葡萄糖變旋為β構型。此外，總膽固醇、甘油三酯都采用酶法的Trinder反應進行測定，但該反應37℃反應較慢，必須測定這些酶試劑反應達到終點的時間，自動分析儀用試劑盒一般可以在全部加樣后5min內反應完全，所以應該選擇分析儀的最大反應時間。

　　 延遲時間

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　　在酶促反應一開始的階段，由于各種因素的影響，酶促反應速率比較慢，可以是幾秒到幾分鐘，尤其是雙底物反應或需要輔酶參與者，通常為1-3min。而一般單試劑法只需30s，常用項目中丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、肌酸激酶需要特別注意。

　　監測時間

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　　酶促反應延滯期后，在過量底物的存在下，反應速率加快并達到一個反應速率穩定的階段，即酶促反應以恒定的速率進行，不受底物濃度的影響，這段時間稱為線性反應期或零級反應期，自動化生化分析儀的監測時間即為此期。測酶的連續監測法至少90-120s或至少4點（3個ΔA），少于3個ΔA不能稱為連續監測法，因為不能計算線性度。監測時間過長則容易發生底物耗盡，可測范圍變窄。

　　試劑吸光度上限、下限

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　　試劑吸光度上限為正向反應用，可參考試劑盒說明書數值折算成所用比色杯的光徑。如試劑盒要求上限為0.4，比色杯光徑0.8cm，則試劑吸光度上限設置為0.32。

　　試劑吸光度下限為負向反應用，設置法同試劑吸光度上限。

　　超過限額表示試劑已變質，應更換合格試劑。

　　底物耗盡限額

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　　不同型號分析儀的設計不一樣，有的為零點與監測第一點吸光度的差額，有的為吸光度上升或下降至指定吸光度的數值。超過限額說明樣品的酶活性非常高，底物消耗太快，在儀器程序規定的線性反應期內吸光度的變化往往不代表真正的酶活力，導致結果偏低，樣品應稀釋5-10倍后重測。

　　線性度

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　　線性度是指“線性錯誤”或“線性誤差”，其計算公式為：（A1-A2）/A3 × 100%，式中：A1為前2/3讀數時間的斜率，A2為后2/3讀數時間的斜率，A3為總的斜率。線性百分數大，說明ΔA之間已不成線性，超過限額說明底物不足，檢測結果會變低，應稀釋后重測。

　　試劑空白速率

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　　試劑空白速率為試劑在監測過程中底物自動降解得到的結果。其值為以水代樣品測得的項目結果，樣本測定結果應扣除試劑空白速率。

　　線性范圍

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　　按試劑的質量而設置，超過范圍應增加樣品量或稀釋后重測。不同試劑公司的試劑質量不一樣，不同樣品試劑比的線性范圍也不一樣，應實測試劑盒的線性范圍。終點法可配制系列不同濃度的標準液，按分析項目的波長、樣品量、試劑量、孵育時間，測定各濃度的吸光度，繪制標準曲線，在線性內的最高濃度為線性上限。

　　計算因子F值（或系數K）

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　　14.1 理論F值

　　用連續監測法進行酶活性測定時，不需作標準管或標準曲線，根據摩爾消光系數很容易進行酶活性濃度的計算。先測定在線性范圍內每分鐘吸光度的變化（ΔA/min），以U/L代表酶活性濃度時，則可按下式進行計算：

　　U/L=ΔA/min=ΔA/min×V×106/(ε×v×1)

　　式中V：反應體系體積（ml）；

　　ε：摩爾吸光系數（cm2/mol）；

　　v：樣品量（ml）；

　　l：比色杯光徑（cm）；

　　ΔA：吸光度變化；

　　106：將mol換算成μmol。

　　因此當條件固定時，從理論上講V、v和l均為固定值，ε為常數，則上述公式可以簡化為U/L=ΔA/min×F，F=V×106/(ε×v×1)。

　　系數F值對酶的測定十分重要，過高雖然測定的線性較寬，但重復性差，反之，雖然精密度好，但檢測線性窄，因此應根據實際情況進行合理的設置和應用，F值的設置應參考酶參考值的上限及測定時間兩方面，以保證測定結果的可靠。

　　14.2 實際F值

　　在臨床實際工作中，儀器諸多因素如波長的準確性、半波寬的大小、比色杯光徑及磨損與清潔度、溫控的準確性、加樣系統狀況等若不符合要求或發生變化都會影響指示物的ε值或上述公式中的相關項。因此，應在具體儀器條件下，定期檢查和實際測定指示物的ε和系數F值（即儀器的實測F值）。

　　 NAD（P）H的ε值因NAD（P）H不穩定，可用葡萄糖的己糖激酶法實測，其原理為：

　　GLU + ATP----HK  ----G-6-P + ADP ；

　　G-6-P + NAD（P）+  ----G-6-PD  ----6-磷酸葡萄糖酸 + NAD（P）H + H+

　　將某一濃度的葡萄糖溶液（可設為10 mmol/L）重復5-10次測定，得到相應的吸光度，求出A bar±s，s必須低于儀器規定的批內允許值。

　　根據ε =A bar/（C×l）× V/v求出NAD（P）H的實際ε值，式中C為標準液濃度（mol/L)；l為比色杯光徑（cm）；V為反應總體積（ml）；v為樣品體積（ml）。再根據U/L=ΔA/min × F，得到實際F值= C×106/A bar。

　　此外，一些色素源指示物在不同的介質環境中，其ε會發生程度不等的變化。對于對硝基苯酚、對硝基苯胺和5-硫代-2-硝基苯甲酸等測這類可得到高純而穩定的指示物，可將其配置在一定的介質中，按臨床標本用的現場試劑和儀器測定吸光度求實測ε及實側F值。

　　 前區檢查

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　　免疫比濁分析過程中必須設置。比較免疫比濁分析過程中后兩個讀數點的差別，如果后一點比前一點的吸光度低，則表示抗原已過剩，應將樣品稀釋后重測。

　　 線性回歸方程

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　　以標準液代樣品在儀器上測得的結果為橫坐標，標準液的實際濃度為縱坐標繪制而成的曲線，其中A為曲線在縱軸上的截距，B為曲線的斜率，用于修正檢測結果。