(1)為外源基因提供進入受體細胞的轉移能力。從理論上講，任何DNA分子均可以物理滲透的方式進入生物細胞中，但這種頻率極低，以至于在常規的實驗中難以檢測到。某些種類的載體DNA分子本身具有高效轉入受體細胞的特殊生物學效應，因此由外源基因與載體拼接所形成的DNA重組分子轉入受體細胞的概率比外源DNA片段單獨轉化要高幾個數量級。
(2)為外源基因提供在受體細胞中的復制能力或整合能力。外源基因進入受體細胞后面臨兩種選擇，或者直接整合在受體細胞染色體DNA的某個區域內，作為其一部分復制并遺傳，或者獨立于受體細胞染色體DNA而存在，在后一種情況下，載體DNA分子必須為外源基因提供獨立的復制功能，否則外源基因不可能在受體細胞中復制和遺傳。
(3)為外源基因提供在受體細胞中的擴增和表達能力。外源基因的擴增依賴于載體分子在受體細胞中高拷貝自主復制的能力，這種能力通常由載體DNA上的若干相關基因編碼。同時，外源基因高效表達所需的調控元件一般也由載體分子提供。
應當指出的是，上述三大功能并非所有的載體分子都必須具備，DNA重組克隆的目的不同，對載體分子的性能要求也不同。但對于所有不同用途的載體而言，為外源基因提供復制或整合能力是必不可少的，因此通常選擇生物體內天然存在的質粒以及噬菌體或病毒DNA作為載體藍本，并根據分子克隆的操作原理，對之進行必要的修飾和改造，構建出具有多種性能的載體DNA分子。