用普通共聚焦顯微鏡實現超分辨率單分子熒光成像

發布時間：2020-02-26 00:29 原文鏈接：用普通共聚焦顯微鏡實現超分辨率單分子熒光成像

傳統的細胞及其內部分子顯微觀察通常使用熒光染料，然后再用不同分辨率的顯微術照亮單個分子和與其互動的其他物質。如下圖所示，普通共聚焦顯微鏡和超分辨率顯微鏡的精準度差異一目了然。

（普通共聚焦顯微鏡觀察圖，比例尺10μm。圖片來自發表文章DOI: 10.1038/s41467-017-00688-0）

（隨機光學重構顯微鏡觀察圖，比例尺2μm。圖片來自發表文章DOI: 10.1364/BOE.8.005087）

然而，一張超分辨率細胞圖往往需要高度專業化技能和昂貴設備作為支撐。全球有多少實驗室能為單分子觀察提供成熟的平臺？

為了讓更多生物醫學研究者享受超分辨率顯微術，哈佛Wyss生物工程研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering）尹鵬（Peng Yin）博士和Max Planck研究所（Max Planck Institute，MPI）的Ralf Jungmann博士等人共同開發了一款強大的分子成像技術“DNA-PAINT”，它可以與一般細胞生物學實驗都有、但分辨率較低的共聚焦顯微鏡配套使用，實現細胞內各種分子，如蛋白質、RNAs和DNA的超分辨率觀察。

這篇發表于《Nature Communications》最新文章，推開了普及“納米級單分子細胞精準定位研究”的一扇大門。

DNA-PAINT方法用一個DNA錨定鏈與目標分子相連，一個帶染色標簽的DNA成像鏈攜帶錨定鏈互補序列，成像鏈與錨定鏈瞬時接觸，就會產生一個熒光信號。并非持久的發光形式，這種閃爍型熒光信號，能以更高的分辨率區分納米級的分子間距離。

利用這種方法，研究人員可以清晰地觀察到細胞核內獨立的生物分子，包括DNA序列、蛋白質-DNA復合物、核RNAs，以及圍繞細胞核的核膜。

應用SDC-PAINT觀察細胞骨架微絲(綠色)和微絲相鄰兩種蛋白TOM20 (紅色) 和HSP60 (藍色)，最下方是SDC-PAINT顯微術(左)和共聚焦顯微術(右)效果差異，比例尺 5μm (第一張圖)、500nm (后三張圖)。圖片來源：MPI /Wyss研究所最新發表文章Doi:10.1038/s41467-017-02028-8

共聚焦顯微鏡的原理是利用針孔（pinholes）消除上方和下方的失焦熒光。通過多次逐盤掃描，研究人員得以深層次地獲得目標分子偶聯的染料發出的熒光信號。

MPI /Wyss研究所的技術團隊開發改造的一款“旋轉盤共聚焦（Spinning Disk Confocal，SDC）”顯微鏡，包括多個針孔，該裝置能通過旋轉的方式讓研究人員連續觀察整盤細胞。除此之外，為了實現“3D 超分辨率觀察”，他們還設計了一個鏡頭“補丁”，將其放在觀察路徑上，研究人員可以在亞衍射極限分辨率下觀察細胞內分子的立體圖像。

對顯微鏡制造商來說，這些配件并不難生產，意味著SDC顯微鏡只需在原有共聚焦顯微鏡的基礎上進行簡單升級改造，就能大幅提高細胞內觀察的分辨率。

“我們新開發的這款SDC-PAINT集合了DNA-PAINT的超分辨率和共聚焦顯微鏡的光學分段裝置特征，”Yin和Jungmann說。“這種親民化的超分辨成像方法在細胞和組織學研究領域極具推廣潛力。”

“這是一項重要的技術創新，對生物醫學研究人員來說，該方法簡單易行，如果得到普及將加快我們對細胞內單個分子功能的探索，”Wyss研究所創始主任Donald Ingber博士評價。

原文：Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT