本方案將在疑難解析和誘導啟動子表達蛋白的優化部分討論影響質粒表達效率的因素。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 實驗材料 | 帶有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的適于轉化的大腸桿菌菌株IPTG 誘導的表達載體 |
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| 試劑、試劑盒 | 考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液IPTGSDS 凝膠加樣緩沖液SDS-聚丙烯酰胺凝膠靶基因或 cDNA 片段LB 瓊脂平板LB 培養基 |
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| 儀器、耗材 | SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭沸水浴振蕩培養箝 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液
參見附錄 8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培養基
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 瓊脂平板
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養基
離心機和轉頭
SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭
特別配備
沸水浴
振蕩培養箝
補充試劑
本方案步驟 1 需要第 8 章方案 7 中所列試劑。
本方案步驟 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列試劑。
本方案步驟 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列試劑。
本方案步驟 4 需要第 12 章方案 3 中所列試劑。
載體和細菌菌株
帶有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的適于轉化的大腸桿菌菌株
帶有 lacIq 等位基因的 IPTG 誘導表達質粒（如 PMAL 和 pGEX) 可以轉化實驗室的任何大腸桿菌菌株 (如 JM101,DH5F‘和 TG1)。詳細內容參見本方案。
IPTG 誘導的表達載體
其他載體包括 pGEM-3Z(Promega 公司，見圖 15-4)，pGEX-1（Pharmacia 公司），pKK223-3 (Pharmacia 公司）， pMEX (U.S.Biochemicals 公司），pTrc99A (Pharmacia 公司）和 pMAL (NewEnglandBiolabs 公司）。
陽性對照質粒（表達已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 誘導載體）
方法
含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1.PCR 修飾或限制性內切酶消化分離 DNA 片段，片段 5'端和 3'端帶有與 IPTG 誘導表達載體對應的限制酶位點。
大多數 IPTG 誘導表達載體都含有表達外源蛋白所必需的全部控制元件。RCR 修飾表達 cDNA/基因，使結構兩側沒有無關序列。為方便表達，可以根據所用載體和初步結果. 在片段末端加入其他調控序列（參見本方案疑難解析和誘導啟動子表達蛋白的優化)。
為確定擴增反應沒有引入錯誤突變，應對 PCR 產物進行序列分析。
2. 含靶 CDNA/基因的 DNA 片段與表達載體連接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 重組質粒轉化有 lacIq 等位基因的大腸桿菌菌株。如果質粒本身有 lacI 基因，可以使用任何適當的大腸桿菌菌株。將轉化體鋪于含氨芐（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 過夜培養。
空的表達質粒（陰性對照）和陽性對照質粒轉化相間的大腸桿菌菌株。
4. 通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插人片段的轉化體（請參見第 12 章方案 3)。
誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體，
5. 對照菌和重組菌分別挑取 1~2 個菌落，接入 lml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 LB 培養液，適當溫度（20~37°C) 培養過夜。
大腸桿菌在室溫的生長速度比在 37°C 慢 4 倍，所以~20°C 培養過夜（~16 h) 可能達不到飽和。但低溫時細菌代謝緩慢，不容易形成包涵體。請參見本章前言不溶性蛋白的處理部分。
6. 取 50ul 過夜培養物接入 5 ml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 LB 培養液，20~37°C 振蕩培養 2 h 以上，至對數中期（A550=0.5~1.0)。
7. 吸出 1ml 未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟 9 和 10 所述進行處理。
8. 在剩余培養物中加入 IPTG 至終濃度 1mmol/L，20~37°C 繼續通氣培養（參見下面 IPTG 濃度和誘導溫度的優化）。
IPTG 的濃度對表達水平影響非常大。1mmol/L 只是一個起點，也是一個比較離的濃度。實驗中, 應在 0.01~5.0 mmol/L 的范圍內改變 IPTG 濃度，尋找最佳使用濃度。對于有些蛋白，必須誘導表達質粒慢轉錄, 才不致于使細菌的生物合成系統過載。
影響在大腸桿菌中獲得高水平表達的最重要因素可能是生長溫度，通過實驗確定最佳溫度. 是表達外源蛋白的關鍵。雖然在 15~42°C 之間都獲得過成功表達，但表達某一種特定蛋白質的最佳溫度范圍則可能很窄，只有 2~4°C。溫度有時對表達水平起著決定作用，而有時卻對表達水平沒有任何影響，這其中的原因還有待進一步研究，但可能是諸多因素單獨或同時作用的結果。這些因素包括：細菌生長速率、表達產物的胞內折疊、輔基（血紅素、黃素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可獲得性、外源蛋白的熱變性、細胞分泌或折疊器的過載、內原蛋白酶或其他裂解酶的活性、細菌 SOS 修復系統的激活等。由于這些不確定因素的存在，理論推斷最佳生長溫度是不可靠的，必須進行反復的實驗。
9. 在誘導的不同時間（如 1、2、4 和 6 h) 取 1ml 樣品放于微量離心管中，測定 A550, 室溫高速離心 1 min。
10. 沉淀懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液，100°C 加熱 3 min, 室溫高速離心 1 min, 冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
11. 樣品加熱至室溫，取 40ug 或相當于 0.15OD550 培養物的懸液上樣于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠。
12.8~15V/cm 電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
13. 考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶（請見附錄 8)。
37°C 誘導 30 min 的陽性對照，有一條分子質量為 26kDa 的谷胱甘肽轉移酶（GST) 帶，GST 的量在誘導過程中持續升高。誘導一定時間的重組菌應有一條與預計大小一致的帶，誘導動力學和蛋白穩定性可能不同于 GST 對照。
大量表達靶蛋白
14. 挑取一個重組大腸桿菌菌落接入 50 ml 含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養液，在 250 ml 搖瓶中于 20~37°C 過夜培養。
15. 取 5~50 ml 過夜培養物接入 450~500 ml 含氨芐（50 ug/ml) 的 LB 培養液，在 2L 搖瓶中于 20~37°C 振蕩培養過夜，至對數中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以預試驗確定的最佳 IPTG 濃度、最佳時間和最佳溫度誘導表達靶蛋白。
17. 誘導適當時間后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞，繼續后面的純化方案：
? 如果表達的是 GST 融合蛋白，繼續方案 5
? 如果表達的是麥芽糖結合蛋白融合蛋白，繼續方案 6
? 如果表達產物帶有組氨酸標簽，繼續方案 7
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