| 實驗步驟 |
材料
緩沖液和溶液
貯存液、緩沖液和試劑的成分參見附錄 1。
貯存液稀釋至適當濃度。
考馬斯亮藍染色溶液或銀染溶液
參見附錄 8。
IPTG(1mol/L)
1XSDS 凝膠加樣緩沖液
不含 DTT 的 1xSDS 凝膠加樣緩沖液室溫保存，1mol/LDTT 貯存液現用現加于上述緩沖液。
凝膠
SDS-聚丙烯酰胺凝膠（10%)
用于分離蛋白的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠的制備參考附錄 8。
核酸和寡核苷酸
靶基因或 cDNA 片段
培養基
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 瓊脂平板
含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養基
離心機和轉頭
SorvallGSA 轉頭或相當的轉頭
特別配備
沸水浴
振蕩培養箝
補充試劑
本方案步驟 1 需要第 8 章方案 7 中所列試劑。
本方案步驟 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列試劑。
本方案步驟 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列試劑。
本方案步驟 4 需要第 12 章方案 3 中所列試劑。
載體和細菌菌株
帶有 lacIq 或 lacIq1 等位基因的適于轉化的大腸桿菌菌株
帶有 lacIq 等位基因的 IPTG 誘導表達質粒（如 PMAL 和 pGEX) 可以轉化實驗室的任何大腸桿菌菌株 (如 JM101,DH5F‘和 TG1)。詳細內容參見本方案。
IPTG 誘導的表達載體
其他載體包括
pGEM-3Z(Promega 公司，見圖 15-4)，pGEX-1（Pharmacia 公司），pKK223-3 (Pharmacia
公司）， pMEX (U.S.Biochemicals 公司），pTrc99A (Pharmacia 公司）和 pMAL
(NewEnglandBiolabs 公司）。
陽性對照質粒（表達已知大小的 LacZ 融合蛋白的 IPTG 誘導載體）
方法
含重組表達載體的大腸桿菌菌株的構建
1.PCR 修飾或限制性內切酶消化分離 DNA 片段，片段 5'端和 3'端帶有與 IPTG 誘導表達載體對應的限制酶位點。
大多數 IPTG 誘導表達載體都含有表達外源蛋白所必需的全部控制元件。RCR 修飾表達 cDNA/基因，使結構兩側沒有無關序列。為方便表達，可以根據所用載體和初步結果. 在片段末端加入其他調控序列（參見本方案疑難解析和誘導啟動子表達蛋白的優化)。
為確定擴增反應沒有引入錯誤突變，應對 PCR 產物進行序列分析。
2. 含靶 CDNA/基因的 DNA 片段與表達載體連接（第 1 章方案 17 或 19)。
3. 重組質粒轉化有 lacIq 等位基因的大腸桿菌菌株。如果質粒本身有 lacI 基因，可以使用任何適當的大腸桿菌菌株。將轉化體鋪于含氨芐（50ug/ml) 的 LB 平板，于 37°C 過夜培養。
空的表達質粒（陰性對照）和陽性對照質粒轉化相間的大腸桿菌菌株。
4. 通過菌落雜交和/或小量制備質粒的限制酶切分析、寡核苷酸雜交或序列分析篩選帶有插人片段的轉化體（請參見第 12 章方案 3)。
誘導靶蛋白表達的優化
許多研究表明細胞生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此必須對接種細菌量、誘導前細胞生長時間和誘導后細胞密度進行控制。生長過度或過速都會加重細菌合成系統的負擔，導致形成包涵體，
5. 對照菌和重組菌分別挑取 1~2 個菌落，接入 lml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 LB 培養液，適當溫度（20~37°C) 培養過夜。
大腸桿菌在室溫的生長速度比在 37°C 慢 4 倍，所以~20°C 培養過夜（~16 h) 可能達不到飽和。但低溫時細菌代謝緩慢，不容易形成包涵體。請參見本章前言不溶性蛋白的處理部分。
6. 取 50ul 過夜培養物接入 5 ml 含氨芐青霉素（50ug/ml) 的 LB 培養液，20~37°C 振蕩培養 2 h 以上，至對數中期（A550=0.5~1.0)。
7. 吸出 1ml 未經誘導的培養物放在一個微量離心管中，按下面步驟 9 和 10 所述進行處理。
8. 在剩余培養物中加入 IPTG 至終濃度 1mmol/L，20~37°C 繼續通氣培養（參見下面 IPTG 濃度和誘導溫度的優化）。
IPTG
的濃度對表達水平影響非常大。1mmol/L 只是一個起點，也是一個比較離的濃度。實驗中, 應在 0.01~5.0 mmol/L 的范圍內改變
IPTG 濃度，尋找最佳使用濃度。對于有些蛋白，必須誘導表達質粒慢轉錄, 才不致于使細菌的生物合成系統過載。
影響在大腸桿菌中獲得高水平表達的最重要因素可能是生長溫度，通過實驗確定最佳溫度.
是表達外源蛋白的關鍵。雖然在 15~42°C 之間都獲得過成功表達，但表達某一種特定蛋白質的最佳溫度范圍則可能很窄，只有
2~4°C。溫度有時對表達水平起著決定作用，而有時卻對表達水平沒有任何影響，這其中的原因還有待進一步研究，但可能是諸多因素單獨或同時作用的結果。這些因素包括：細菌生長速率、表達產物的胞內折疊、輔基（血紅素、黃素、腺嘌呤二核苷酸、生物素等）的可獲得性、外源蛋白的熱變性、細胞分泌或折疊器的過載、內原蛋白酶或其他裂解酶的活性、細菌
SOS 修復系統的激活等。由于這些不確定因素的存在，理論推斷最佳生長溫度是不可靠的，必須進行反復的實驗。
9. 在誘導的不同時間（如 1、2、4 和 6 h) 取 1ml 樣品放于微量離心管中，測定 A550, 室溫高速離心 1 min。
10. 沉淀懸于 100ul 1XSDS 凝膠加樣緩沖液，100°C 加熱 3 min, 室溫高速離心 1 min, 冰上放置，待全部樣品處理完后上樣。
11. 樣品加熱至室溫，取 40ug 或相當于 0.15OD550 培養物的懸液上樣于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠。
12.8~15V/cm 電泳，至溴酚蘭遷移到分離膠底部。
13. 考馬斯亮藍染色或銀染，或免疫印跡，觀察表達產物條帶（請見附錄 8)。
37°C 誘導 30 min 的陽性對照，有一條分子質量為 26kDa 的谷胱甘肽轉移酶（GST) 帶，GST 的量在誘導過程中持續升高。誘導一定時間的重組菌應有一條與預計大小一致的帶，誘導動力學和蛋白穩定性可能不同于 GST 對照。
大量表達靶蛋白
14. 挑取一個重組大腸桿菌菌落接入 50 ml 含氨芐（50ug/ml) 的 LB 培養液，在 250 ml 搖瓶中于 20~37°C 過夜培養。
15. 取 5~50 ml 過夜培養物接入 450~500 ml 含氨芐（50 ug/ml) 的 LB 培養液，在 2L 搖瓶中于 20~37°C 振蕩培養過夜，至對數中期（A550=0.5~1.0)。
16. 以預試驗確定的最佳 IPTG 濃度、最佳時間和最佳溫度誘導表達靶蛋白。
17. 誘導適當時間后，于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 轉頭）離心 15 min 收集細胞，繼續后面的純化方案：
? 如果表達的是 GST 融合蛋白，繼續方案 5
? 如果表達的是麥芽糖結合蛋白融合蛋白，繼續方案 6
? 如果表達產物帶有組氨酸標簽，繼續方案 7
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